低溫脅迫肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的變化

李芳菲 王 博 石 碩 潘 男 鄧思楊 夏秀芳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 哈爾濱150030）

肉品的保藏方法很多，目前應(yīng)用最廣泛、效果最好、最安全的是低溫處理，即肉的冷凍[1]。冷凍能抑制微生物生長(zhǎng)繁殖、抑制酶的活性，以延長(zhǎng)食品的貨架期，然而凍藏溫度和時(shí)間直接影響食品中的冰晶大小、分布，進(jìn)而影響解凍過(guò)程滲出物的多少和最終食品的質(zhì)量[2]。

凍藏雖然是比較有效的保藏肉類食品的方法，但是凍藏過(guò)程中肉類質(zhì)量也會(huì)變壞，如脫水、質(zhì)量損失、汁液流失、變硬、微生物污染和自溶等[3]。在此過(guò)程中最主要的變化是肌原纖維蛋白的變性以及由此引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性和功能性的下降[4]。Benjakl[5]研究了蟹凍藏在-20 ℃條件下的物理和化學(xué)變化：ATPase 活性、表面疏水性、蛋白質(zhì)溶解性、pH 值均不斷降低，疏基含量減少、二硫鍵和甲醛的含量不斷增加。Benjkl[6]發(fā)現(xiàn)冰藏過(guò)程中蛇鰭肌肉蛋白的Ca2+-ATPase 酶的活性逐漸降低，Mg2+-EGAT-ATPase 酶活性逐漸提高。Subramanian[7]用差式熱量掃描儀研究了快速凍結(jié)、緩慢凍結(jié)對(duì)蝦肌肉蛋白熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的影響；Thanonkaew[8]發(fā)現(xiàn)烏賊肉糜-18 ℃肌球蛋白不斷變性使蛋白質(zhì)的保水性明顯降低。目前大多數(shù)研究?jī)霾胤绞綄?duì)肌肉質(zhì)量的影響多集中在水產(chǎn)品 （各類魚(yú)、蝦）上，而對(duì)紅肉（如豬肉）質(zhì)量影響的研究相對(duì)較少，尤其對(duì)肌肉的結(jié)構(gòu)特性和熱穩(wěn)定性的影響。當(dāng)今的食品工業(yè)需要大量的凍結(jié)肉作為原料，為了保證肉制品加工業(yè)穩(wěn)定并獲得高質(zhì)量的原料肉，使質(zhì)量好的凍結(jié)肉在解凍后仍然保持良好的品質(zhì)，就必須選擇適當(dāng)?shù)膬霾販囟群蛢霾貢r(shí)間[9]。

本文以豬肉為研究對(duì)像，通過(guò)測(cè)定豬肉肌原纖維蛋白巰基含量、ATPase 活性和DSC 隨凍藏溫度和凍藏時(shí)間的變化情況，探討低溫脅迫下對(duì)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的影響情況，為實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉是來(lái)自北大荒肉業(yè)宰后冷卻24 h 的長(zhǎng)白豬背最長(zhǎng)肌，放入2 倍體積的冰中運(yùn)到東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)所用試劑均為分析純，購(gòu)于哈爾濱市萬(wàn)太生物藥品公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-104 型精密電子天平，常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司；DK-8B 型電熱恒溫水浴鍋，西化儀科技有限公司；pHS-25 型pH 計(jì)，上海精科雷磁儀器廠；TGL-16C 型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；TU-1800 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司；T18 高速勻漿機(jī)，德國(guó)IKA 公司；PE Pyris 6 差示量熱儀DSC，美國(guó)生產(chǎn)；VE-180 垂直電泳槽，上海天能科技有限公司；BIORAD 電泳儀，美國(guó)生產(chǎn)；凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取 選取豬背部最長(zhǎng)肌，去除可見(jiàn)脂肪和結(jié)蹄組織后，將瘦肉切成小塊絞碎備用。提取參照Liu 等人[10]的方法并略加修改，將肉糜放入預(yù)冷的燒杯中稱重，加入4 倍體積的提取液 （10 mmol/L 磷酸鹽、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0）勻漿60 s，在4 ℃、3 500 r/min 條件下冷凍離心15min，取沉淀，以同樣方法再提取兩次，將沉淀中加入4 倍體積洗液（0.1 mol/L NaCl）勻漿60 s，在4 ℃、3 500 r/min 條件下冷凍離心15 min，去上清液，重復(fù)洗1 次，去上清液后再加4 倍體積洗液，勻漿60 s，4 層紗布過(guò)濾，用0.1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至6.0，冷凍離心15 min（3 500 r/min，4 ℃），得到沉淀即為肌原纖維蛋白，在4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，存?chǔ)時(shí)間不得超過(guò)48 h。用雙縮脲法測(cè)定其蛋白含量。整個(gè)提取過(guò)程需在4 ℃條件下完成。

1.3.2 蛋白質(zhì)ATPase 酶活性的測(cè)定 肌原纖維蛋白ATPase 酶活性按Wells 等[11]和Katoh 等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定，肌原纖維蛋白配制成3.0 mg/mL 的溶液，酶活性用μmolPi/mg Pro 來(lái)表示。不同濃度的磷酸二氫鈉（0.0～1.0 mmol/L）做標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算磷酸鹽含量。

①標(biāo)準(zhǔn)曲線 磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 磷酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of phosphate

②Ca2+-ATPase 酶活性的測(cè)定

0.2 mL 肌原纖維蛋白的溶液 （3.0 mg/mL）加入2 mL Ca2+-ATPase 反應(yīng)液 （7.6 mmol/L ATP，15 mmol/L CaCl2·2H2O，150 mmol/L KCl，180 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，25 ℃）反應(yīng)10 min，加入1.0 mL 10%三氯乙酸使反應(yīng)停止，然后2 500 g離心5 min 去除沉淀，取1.0 mL 上清液加入3.0 mL 0.66%的鉬酸銨（溶解在0.75 N 硫酸中），混合后加入0.5 mL 新配制的10% FeSO4溶液，反應(yīng)2 min 后在700 nm 處測(cè)定吸光值。

將Ca2+-ATPase 反應(yīng)液中150 mmol/L KCl 和15 mmol/L CaCl2分別用0.3 mol/L KCl 和5.0 mmol/L EDTA 代替配制成K+-ATPase 反應(yīng)液，步驟同Ca2+-ATPase 酶活性的測(cè)定。

1.3.3 活性巰基和總巰基含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)發(fā)生氧化可使巰基 （SH-）形成二硫鍵 （-S-S-），所以活性巰基和總巰基含量可以作為蛋白氧化的一個(gè)重要指標(biāo)。

①活性巰基含量的測(cè)定 取1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的MPI 溶液用8 mL Tris-甘氨酸溶液處理（pH=8，含有10.4 g Tris，6.9 g 甘氨酸，1.2 g EDTA/L）然后經(jīng)均質(zhì)和10 000 r/min 離心15 min，除去不溶性蛋白。上清液中取4.5 mL 和0.5 mL 10 mmol/L Ellman 試劑反應(yīng)（此試劑制備含有4 mg/mL 的2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DTNB），用pH=8.0 Tris－甘氨酸緩沖液），空白中含有4.5 mL Tris-甘氨酸和0.5 mL 10 mmol/L Ellman 試劑，反應(yīng)30 min 后利用UV 分光光度計(jì)分別在412 nm 和540 nm 處測(cè)量吸光值。

活性巰基含量由下式估算：

μmoL SH/g WPI=73.53×（AB412－1.6934×AB540＋0.009923）/mg MPI

②總巰基含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)的總巰基基團(tuán)含量的測(cè)定，是參考Simplicio 等[13]描述的Ellman 方法，使用DTNB 進(jìn)行測(cè)定，方法如下：取1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的MPI 溶液用8 mL Tris-甘氨酸溶液處理（pH 8，每升該溶液中含有10.4 g Tris，6.9 g 甘氨酸，1.2 g EDTA，8 moL 尿素），然后經(jīng)均質(zhì)和10 000 r/min 離心15 min，除去不溶性蛋白。上清液中總巰基含量按照Ellman 方法測(cè)定。4.5 mL 上述樣品和0.5 mL 10 mmol/L Ellman 試劑反應(yīng)，30 min 后利用UV 分光光度計(jì)在412 nm 處測(cè)定吸光值，巰基濃度計(jì)算使用摩爾消光系數(shù)13 600（mol/L）-1·cm-1，被溶解的蛋白含量使用雙縮脲法測(cè)定。對(duì)照組不加蛋白溶液，其它處理方法相同。

1.3.4 肌原纖維蛋白質(zhì)的聚合和小片化 肌原纖維蛋白質(zhì)氧化后可能發(fā)生聚合和小片化，可以采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）來(lái)分析氧化前后蛋白質(zhì)的變化。SDS-PAGE：參照Laemml[14]電泳方法，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%，電極緩沖液含 0.05 mol/L Tris，0.384 mol/L 甘氨酸，0.1%SDS（pH 8.3），電泳樣品用樣品溶解液（內(nèi)含 4%SDS，10%的β-巰基乙醇或50 mmol/L N-乙基順丁烯二酰亞胺（NEMI），20%甘油，0.02%溴酚藍(lán)，0.125 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 6.8）配制成最終蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL，振動(dòng)混合1 min，100 ℃水浴3 min。電泳采用1 mm 凝膠板；上樣量12 μL；開(kāi)始電泳時(shí)電流20 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后改為40 mA；取出膠片用考瑪斯亮藍(lán)染色3 h（染色液含有50%的甲醇，6.8%的冰醋酸和1 mg/mL的考馬斯亮藍(lán)），用甲醇/冰醋酸脫色液脫至透明（脫色液中含有5%的甲醇和7.5%的冰醋酸）。電泳膠片置于天能凝膠成像儀攝像，結(jié)合Tanon 軟件進(jìn)行分析和處理。SDS-PAGE 標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白由中科院上海生物化學(xué)研究所提供。標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白如下：肌球蛋白（豬），分子質(zhì)量（MW）為200 ku；β-半乳糖苷酶、大腸桿菌，分子質(zhì)量為116 ku；磷酸酶b（兔子肌肉），分子質(zhì)量為97.2 ku；牛血清白蛋白，分子質(zhì)量為66.4 ku；卵清蛋白（雞蛋白），分子質(zhì)量為44.3 ku；碳酸苷酶（牛），分子質(zhì)量為29.0 ku；胰蛋白酶抑制劑（大豆），分子質(zhì)量為20.1 ku；溶菌酶 （雞蛋白），分子質(zhì)量為14.3 ku；抑制肽（牛），分子質(zhì)量為6.5 ku。

1.3.5 蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的測(cè)定 經(jīng)過(guò)凍結(jié)后肉中蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化，通過(guò)示差掃描熱量計(jì)（differential scanning calorimeter，DSC）測(cè)定蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的變化情況。精確稱量肌原纖維蛋白15 mg 放入樣品池，放置DSC 儀器的樣品支持器上，調(diào)整好儀器，用空盒做對(duì)照。試驗(yàn)采用的測(cè)定溫度范圍為30～90 ℃，加熱速度為10 ℃/min。采用pyris6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和處理得到DSC曲線，峰值點(diǎn)溫度為變性溫度，曲線形成的峰包括的面積理論上為蛋白質(zhì)變性所吸收熱量。每個(gè)樣品重復(fù)3 次取平均結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用Statistix 8.1 （分析軟件，St Paul，MN）軟件進(jìn)行，使用Tukey HSD 程序進(jìn)行差異顯著性（P<0.05）分析，采用Sigmaplot 10.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白ATPase 活性的變化

豬肉肌原纖維蛋白ATPase 活性變化如圖2所示。隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)肌原纖維蛋白質(zhì)的Ca2+-ATPase 和K+-ATPase 活性明顯降低，其中K+-ATPase 的降低速度比Ca2+-ATPase 快，說(shuō)明K+-ATPase 對(duì)凍藏條件更敏感。

Ca2+-ATPase 在不同凍結(jié)溫度下均隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，且變化趨勢(shì)基本相似。-5和-18 ℃凍藏1 個(gè)月后，Ca2+-ATPase 下降非常明顯，分別下降了30.2%和17.2%；-18 ℃凍藏3 個(gè)月Ca2+-ATPase 下降不明顯，而-5 ℃凍藏明顯下降，兩個(gè)凍藏溫度下12 個(gè)月時(shí)Ca2+-ATPase 分別為0.1256 μmol/mg MPI 和0.1632 μmol/mg MPI，僅為新鮮肉中肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性的34.1%和44.4%。這說(shuō)明豬肉在較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間凍藏明顯降低肌肉蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；-26 和-35℃整個(gè)凍藏期內(nèi)Ca2+-ATPase 活性下降趨勢(shì)相似，到12 個(gè)月時(shí)Ca2+-ATPase 活性為0.2025 μmol/mg MPI 和0.2035 μmol/mg MPI，二者差異不顯著（P＞0.05）；-70 ℃凍藏Ca2+-ATPase 活性在前6 個(gè)月變化下降了9.6%，貯藏到12 個(gè)月時(shí)下降了31.2%，與-5 ℃凍藏條件下1 個(gè)月（30.2%）相當(dāng)，且與其它凍藏溫度之間存在顯著性差異（P<0.05）。

-5 ℃條件下貯藏時(shí)K+-ATPase 活性隨著時(shí)間的增加而明顯降低，從新鮮肉的0.2526 μmol/mg MPI 下 降 到0.0568 μmol/mg MPI，下 降 了77.5%；-18，-26，-35 和-70 ℃條件下貯藏時(shí)K+-ATPase 活性前3 個(gè)月降低較明顯，分別下降了42.0%，39.6%，30.0%和25.3%，后期下降較慢，K+-ATPase 下降了60.1%，60.9%，59.2%和50.3%，各溫度間差異顯著（P<0.05）。這說(shuō)明K+-ATPase 活性變化與凍藏溫度和時(shí)間直接相關(guān)，凍結(jié)溫度越高下降得越快、凍藏時(shí)間越長(zhǎng)下降得越多。

圖2 冷凍溫度、貯藏時(shí)間對(duì)豬肉肌原纖維蛋白質(zhì)ATPase 活性的影響Fig.2 Influence of freezing temperature and times on the ATPase activity of porcine myofibrillar proteins

凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白ATPase 活性下降的原因有很多：Ca2+-ATPase 活性的降低是由于肌球蛋白球狀頭部構(gòu)象變化和交聯(lián)引起的。凍結(jié)過(guò)程由于冰結(jié)晶的機(jī)械作用使肌球蛋白頭部變性，引起ATPase 活性的降低，另外凍藏引起巰基氧化（圖3）形成二硫鍵也會(huì)使ATPase 活性下降。曾名湧[15]認(rèn)為在-10 和-20 ℃下凍藏時(shí)羅非魚(yú)肌球蛋白ATPase 活性下降是由于巰基氧化和pH 下降兩個(gè)因素作用的結(jié)果，而在-30 和-40 ℃下凍藏時(shí)主要是由于巰基氧化引起的。ATPase 活性下降可能是由于肌球蛋白球狀頭部發(fā)生交聯(lián)而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象[16]，也可能是由于凍融過(guò)程使蛋白質(zhì)分子間相互作用面發(fā)生重排引起的[17]。Wagner 和Anon[18]發(fā)現(xiàn)凍藏中牛肉中肌原纖維蛋白的ATPase活性下降。蛋白質(zhì)分子間相互交聯(lián)使蛋白質(zhì)發(fā)生重排也會(huì)降低ATPase 活性[19]。

2.2 肌原纖維蛋白巰基含量的變化

圖3 冷凍溫度、貯藏時(shí)間對(duì)豬肉肌原纖維蛋白巰基含量的影響Fig.3 Influence of freezing temperature and times on the sulfhydryl of porcine myofibrillar protein

從圖3可以看出凍藏溫度和時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白的巰基含量有顯著的影響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)巰基含量降低、凍結(jié)溫度越高巰基含量下降越快。-5 ℃條件下凍藏1，3，6，9，12 個(gè)月時(shí)巰基含量隨著時(shí)間的增加而明顯降低，從新鮮肉的102.36 μmol/mg 分 別 下 降 到83.3，69.64，62.36，58.46 和54.23 μmol/mg，其中前3 個(gè)月下降更為明顯，下降32.0%，貯藏后期下降較緩慢；-18 和-26 ℃兩個(gè)貯藏溫度下總的巰基含量變化差異不顯著，分別下降了37.2%和35.2%，只在下降速度上有些差異如在-18 ℃貯藏第1 個(gè)月和第3 到6 個(gè)月下降較快；-35 和-70 ℃條件下貯藏時(shí)巰基含量的變化趨勢(shì)相似，分別下降了24.1%，13.4%。凍藏-70 ℃條件巰基含量總損失相當(dāng)于貯藏在-5，-18，-26 和-35℃條件下的1 個(gè)月（15.3%）、3 個(gè)月（13.7%）、3 個(gè)月（12.9%）、6 個(gè)月（14.1%）。這說(shuō)明低溫凍藏可減緩巰基含量的變化?？偟膸€基含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，這與Sompongse 等[20]研究結(jié)果一致，在冰中貯藏的鯉魚(yú)肌動(dòng)球蛋白總巰基含量降低?？値€基含量減少可能是由于SH 氧化形成二硫化物[21]。在凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白巰基含量的下降可能是由于水形成冰結(jié)晶后，破壞肌原纖維蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使巰基暴露出來(lái)，進(jìn)而被氧化成二硫鍵使巰基含量下降。Hamre 等[22]研究表明，大眼海魚(yú)在-18 ℃冷藏時(shí)，總巰基含量隨冷藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降，而二硫鍵含量卻上升。表明二硫鍵的形成是導(dǎo)致大眼海魚(yú)肉蛋白冷凍變性的重要原因。烏賊凍藏16 周后肌球蛋白的巰基含量隨著二硫鍵增加（從13.10 mol/g 蛋白質(zhì)增加到15.75 mol/g 蛋白質(zhì)）而減少 （從5.40 mol/g 蛋白質(zhì)下降到3.81 mol/g 蛋白質(zhì)）[23]。

凍藏時(shí)間延長(zhǎng)、 溫度升高活性巰基含量也明顯降低，在同一貯藏期各貯藏溫度間活性巰基含量變化差異顯著（P<0.05），如在第6 個(gè)月-5，-18，-26，-35 和-70 ℃的活性巰基含量分別是16.3，21.4，26.7，31.3，34.6 μmol/mg。特別在-70 ℃凍藏3 個(gè)月活性巰基含量變化很小，從新鮮肉的36.54到35.63 μmol/mg。Lin 等[24]研究鯖魚(yú)活性巰基含量隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，-20 ℃條件下凍藏0，2，4，6，8 個(gè)月后活性巰基的含量分別是30.8，27.5，26.3，24 和22.5 mol/g，即凍藏時(shí)間延長(zhǎng)肌肉蛋白的活性巰基含量明顯降低。

巰基氧化形成二硫鍵使總的巰基含量降低，肌球蛋白巰基的氧化也會(huì)降低ATP 活性，降低肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的穩(wěn)定性[25]。肌球蛋白分子中含有活性琉基，這些疏基可分為三類，SH1、SH2、SHa。其中SH1、SH2分布在肌球蛋白的頭部，與肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性密切相關(guān)。而SHa 位于輕酶解肌球蛋白部分（lightmeromyosin，LMM），與肌球蛋白重鏈（Myosinheavychain，MHC）的氧化及二聚物的形成密切相關(guān)。此外，尚有一些巰基隱藏在肌球蛋白分子內(nèi)部，總巰基即包括活性巰基和隱藏巰基。Thanonkaew 等[26]研究表明，在凍藏過(guò)程中，肌原纖維蛋白的活性巰基被氧化形成二硫鍵，因此蛋白質(zhì)的冷凍變性會(huì)使其活性巰基或總巰基的含量減少，而二硫鍵的含量增加，新鮮藍(lán)鰭魚(yú)肉中每105 g 肌動(dòng)蛋白約含有4 個(gè)活性巰基、0.5～1 個(gè)隱藏在分子內(nèi)的巰基和一個(gè)二硫鍵，但在-10 ℃凍藏10 d 后，活性巰基只剩下兩個(gè)，而二硫鍵增加了一個(gè)，隱藏的巰基含量不變，表明在凍藏中活性巰基氧化成了二硫鍵。在凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化伴隨著活性巰基的暴露，而且活性巰基非常容易氧化形成二硫鍵。蛋白質(zhì)變性的實(shí)質(zhì)是巰基和二硫鍵的變化[27]。

巰基含量下降可能是由于凍藏過(guò)程中肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子內(nèi)部的巰基暴露出來(lái)，進(jìn)而被氧化成二硫鍵所致，巰基含量快速下降的原因可能與Ca2+-ATPase 活性有關(guān)，同時(shí)巰基的氧化尤其是位于肌球蛋白頭部區(qū)域巰基的氧化進(jìn)一步導(dǎo)致了Ca2+-ATPase 活性的下降[28]。

2.3 肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性的變化

肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性變化如表1所示，Tmax1、Tmax2、Tmax3是肌原纖維蛋白熱變性的3個(gè)峰值，分別代表肌球蛋白重鏈、肌球蛋白氫鏈和肌動(dòng)蛋白熱變性溫度；ΔH 表示肌原纖維蛋白的熱焓值。凍藏引起肌肉蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化趨勢(shì)是凍結(jié)溫度越高熱穩(wěn)定性越差，焓值降低越多；凍結(jié)時(shí)間越長(zhǎng)變性溫度下降得越多，焓值降低越快。

凍藏1個(gè)月后Tmax1和Tmax3除-5 ℃與新鮮肉相比明顯降低（從54.8 ℃下降到53.7 ℃；從76.2℃下降到74.9 ℃），其它溫度下變化不明顯，這說(shuō)明肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白對(duì)-5 ℃條件比較敏感，熱穩(wěn)定性降低；Tmax2只有貯藏在-70 ℃變化較小，其它溫度均與新鮮肉相比差異顯著（P<0.05），-18～-35 ℃之間無(wú)顯著性差異 （P＞0.05）；-35和-70 ℃下焓值變化與新鮮肉無(wú)顯著性差異（P＞0.05），-5，-18 和-26 ℃下焓值變化與新鮮肉顯著性差異（P＜0.05），分別降低了7.1%，6.8%和8.7%，三者間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

凍藏6 個(gè)月后Tmax1、Tmax2、Tmax3和ΔH 在各凍藏溫度下與新鮮肉相比均明顯降低，且差異顯著（P＜0.05）。凍結(jié)溫度從高到低Tmax1分別是52.5，53.1，52.9，53.6 和54.1 ℃，它們之間存在著顯著性差異（P＜0.05）。在-5 和-18 ℃條件下貯藏的Tmax2間無(wú)差異，-26，-35 和-70 ℃條件下貯藏的Tmax2間也無(wú)明顯差異，但兩組間差異顯著；各貯藏溫度下的Tmax3差異顯著（P＜0.05），它們分別是73.7，74.6°，74.2，74.9 和75.3 ℃；-5，-18 和-26 ℃，-35 ℃和-70 ℃的焓值也存在顯著性差異（P<0.05），這說(shuō)明肌原纖維中各種蛋白對(duì)凍藏溫度和時(shí)間的敏感性不一致。

凍藏12 個(gè)月后Tmax1、Tmax2、Tmax3和ΔH 在各凍藏溫度下與新鮮肉相比也明顯降低。凍結(jié)溫度從高 到 低Tmax1分 別 下 降 了4，2.9，3.1，2 和1.2 ℃，Tmax2分別下降了4.5，3.1，2，2.6 和1.2 ℃，Tmax3分別下降了2.4，2.3，2，2.3 和1.4 ℃，它們之間存在著顯著性差異（P＜0.05）。凍結(jié)溫度越低，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性下降得越小，表明蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定越高。ΔH在-5，-18，-26，-35 和-70 ℃條件下貯藏分別下降了69.5%，52.2%，36.5%，34.8%和12.2%，彼此間存在顯著性差異（P＜0.05），在-5，-18，-26 ℃，凍藏12 個(gè)月的肉類，其焓值變化下降分別是-70 ℃的5.71，4.27，2.99 和2.85 倍。

凍結(jié)肉的熱力學(xué)特性主要是由于冰晶能在很廣的溫度范圍內(nèi)（0～-40 ℃）形成所引起的。DSC提供了一個(gè)測(cè)量整體組織中所含蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定，也就是說(shuō)不需要提取蛋白就能測(cè)定其穩(wěn)定性，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的分離和提取過(guò)程也會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。Tmax表示蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中開(kāi)始變性的溫度，Tmax越小蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越低。Benjakul和Bauer[29]指出凍結(jié)也會(huì)降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

表1 冷凍溫度、凍藏時(shí)間對(duì)豬肉肌原纖維蛋白最大轉(zhuǎn)變溫度（Tmax）和焓值（ΔH）的影響Table 1 Influence of freezing temperature and times on maximum transition temperatures （Tmax）and ehthalpy （ΔH）of porcine myofibrillar protein

2.4 SDS-PAGE

從圖4和圖5可以看出豬肉肌原纖維蛋白在10%的電泳凝膠中的蛋白質(zhì)條帶，它們可能分別是條帶a 分子質(zhì)量為200 ku 肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MHC），條帶b 分子質(zhì)量97.2 ku 的副肌球蛋白（Paparamyosin），條帶c 分子質(zhì)量45 ku 肌動(dòng)蛋白（Actin），條帶d 分子質(zhì)量40 ku 為原肌球蛋白（Tropomyosin）和條帶e 分子質(zhì)量為36 ku 肌鈣蛋白（Troponin）。為了更清楚了解不同的凍結(jié)溫度和時(shí)間對(duì)肌原纖維蛋白質(zhì)的影響，圖5是相同的凍藏時(shí)間內(nèi)不同凍結(jié)溫度進(jìn)行對(duì)比，圖4是同一溫度下不同貯藏時(shí)間蛋白質(zhì)變化的情況。

圖4 冷凍溫度、凍藏時(shí)間對(duì)豬肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE 的影響Fig.4 Influence of freezing temperature and times on the SDS-PAGE pattern of porcine myofibrillar proteins

從圖4可以看出，在凍藏1 個(gè)月時(shí)，不同的凍結(jié)溫度下肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白條帶變化不是很明顯，特別是在-70 ℃條件下凍藏與新鮮肉非常相似，而副肌球蛋白、原肌球蛋白條帶變淡，凍結(jié)溫度越高，減少的越明顯。凍藏3 個(gè)月后，肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白條帶、副肌球蛋白、原肌球蛋白條帶均變淡，特別是條帶e 肌鈣蛋白變得非常淡，在-5 ℃條件下凍藏所有條帶均明顯變淡。凍藏6 個(gè)月時(shí)，在所有凍藏溫度下肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白條帶、副肌球蛋白、原肌球蛋白條帶也明顯變淡，尤其是-5 和-18 ℃條件下的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白變化十分明顯；-5，-18 和-26 ℃凍藏時(shí)條帶d 原肌球蛋白已消失。凍藏9 個(gè)月時(shí)，各條帶也變淡。凍藏12 個(gè)月時(shí)，所有凍藏溫度下（除-70 ℃）只有肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白3 條條帶，肌鈣蛋白、原肌球蛋白條帶消失，同時(shí)出現(xiàn)2 個(gè)空白區(qū)域，這說(shuō)明凍藏時(shí)間對(duì)肌肉蛋白質(zhì)有明顯的影響。在同一貯藏時(shí)間下，蛋白質(zhì)條帶隨著凍結(jié)溫度的升高而變淡，條帶變淡說(shuō)明蛋白質(zhì)發(fā)生了降解。

從圖5主要說(shuō)明了同一凍結(jié)溫度下不同時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)含量的影響。在-5 ℃條件下凍結(jié)，肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白和原肌球蛋白條帶隨凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯變淡，凍結(jié)到12個(gè)月時(shí)只剩下了條帶a 和c，副肌球蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白消失；凍結(jié)時(shí)間越長(zhǎng)，變淡的趨勢(shì)越明顯。在-18 ℃凍結(jié)，貯藏3 個(gè)月時(shí)蛋白質(zhì)條帶變化不明顯；到第6 個(gè)月時(shí)條帶e 消失，說(shuō)明肉中已不含原肌球蛋白；從6 個(gè)月到12 個(gè)月條帶a、b、c、d 開(kāi)始明顯變淡，說(shuō)明肌球蛋白、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白在凍藏過(guò)程中逐漸降解。在-26 ℃凍結(jié)，貯藏6 個(gè)月各條帶變化不是很明顯，并開(kāi)始變淡，凍藏到12 個(gè)月時(shí)a、b、c、d 明顯變淡，e 條帶消失，說(shuō)明在這個(gè)溫度下凍藏6 個(gè)月對(duì)蛋白質(zhì)含量影響不大，凍藏時(shí)間再延長(zhǎng)肌肉的品質(zhì)就會(huì)受到影響。在-35 ℃凍藏，蛋白質(zhì)條帶變化情況與-26 ℃凍結(jié)相似，6 個(gè)月內(nèi)各條帶變化不是很明顯，貯藏第9 個(gè)月時(shí)所有條帶明顯變淡。在-70 ℃凍結(jié)，凍藏到12 個(gè)月時(shí)，e 條帶消失，a 和c 變化較慢，條帶b 和d 明顯變淡，說(shuō)明在這個(gè)溫度下凍藏肌原纖維蛋白中主要的兩種蛋白肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白變化不是很明顯，這也與其它指標(biāo)的測(cè)定相一致，即凍藏過(guò)程中蛋白質(zhì)損失少保證了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，蛋白質(zhì)的功能特性變化也小。

從圖4和圖5可知，豬肉中所含蛋白對(duì)凍結(jié)溫度和時(shí)間的敏感程度不同。一般來(lái)講凍藏溫度越高（-5 ℃）、凍藏時(shí)間越長(zhǎng)（12 個(gè)月），對(duì)肌原纖維蛋白中所含的蛋白含量影響越大。但對(duì)于不同的蛋白影響程度還有差異，對(duì)于溫度和時(shí)間最敏感的是條帶e 肌鈣蛋白，凍結(jié)在-5 ℃條件下3 個(gè)月明顯變淡，9 個(gè)月時(shí)消失；凍結(jié)在-18 ℃條件6個(gè)月時(shí)消失，-26 和-35 ℃時(shí)9 個(gè)月消失。肌鈣蛋白 （Troponin，TN），它是原肌球蛋白和肌鈣蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白有規(guī)律的結(jié)合決定肌肉收縮和舒張，它的損失引起肌肉結(jié)構(gòu)松散，增加蛋白與氧的接觸機(jī)會(huì)，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生氧化變性，熱穩(wěn)定性降低。在加工和凍藏教程中肌原纖維蛋白中肌球蛋白比肌動(dòng)蛋白和肌鈣蛋白更容易氧化[27]。通常當(dāng)二硫鍵形成時(shí)蛋白質(zhì)開(kāi)始變性和交聯(lián)，隨后疏水基團(tuán)和氫鍵在分子內(nèi)外發(fā)生重排[30]。

圖5 冷凍溫度、凍藏時(shí)間對(duì)豬肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE 的影響Fig.5 Influence of freezing temperature and times on the SDS-PAGE pattern of porcine myofibrillar proteins

3 結(jié)論

通過(guò)研究不同凍藏溫度和凍藏時(shí)間下豬肉肌原纖維蛋白的ATPase 酶活性、巰基含量、SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳和蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，進(jìn)一步確定蛋白質(zhì)的變性機(jī)制。結(jié)果顯示，凍藏過(guò)程中，肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)明顯改變，隨著凍結(jié)溫度升高、凍藏的時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的總巰基含量、活性巰基含量和ATP 酶活性降低；通過(guò)DSC 測(cè)定蛋白的熱穩(wěn)定性的結(jié)果可知，凍藏過(guò)程中肌肉蛋白的熱轉(zhuǎn)變溫度和焓值均降低，凍結(jié)溫度越高、 凍藏時(shí)間越長(zhǎng)，降低得越明顯，表明蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性越差；肌原纖維蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜結(jié)果顯示，凍藏過(guò)程使蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的降解，凍藏時(shí)間越長(zhǎng)、凍藏溫度越高，蛋白質(zhì)分子降解越明顯。因此凍藏過(guò)程破壞了肌肉蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，降低了蛋白的功能特性。所以在運(yùn)輸、貯藏、消費(fèi)過(guò)程中應(yīng)健全冷藏鏈技術(shù)，防止凍藏過(guò)程中溫度波動(dòng)，進(jìn)而減少肌肉品質(zhì)的劣變，防止肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性的改變。