低離子強(qiáng)度下調(diào)節(jié)pH值對鯉肌球蛋白空間構(gòu)象的影響

田元勇 王 偉 宋 揚(yáng) 劉俊榮

（大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧大連116023）

我國淡水漁業(yè)資源豐富，2014年全國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量2 935.76 萬t，占全國水產(chǎn)品總量的45.43%[1]。魚蛋白產(chǎn)品的開發(fā)與利用是大宗低值漁獲物的有效利用途徑，然而，目前低值魚蛋白的利用形式仍以魚粉和魚糜制品為主。魚粉的局限性在于其食用功能性差，只能用作動物飼料，產(chǎn)品附加值和利用率較低。魚糜技術(shù)存在蛋白回收率低，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量廢水且處理難的問題。此外，魚糜技術(shù)對原料蛋白質(zhì)性質(zhì)要求苛刻，在非傳統(tǒng)原料，如中、上層魚類方面的應(yīng)用仍存在很多難題：產(chǎn)品凝膠特性差，脂質(zhì)氧化及血紅素蛋白導(dǎo)致的變色問題，這很大程度上限制了其對大部分低值魚蛋白的加工利用[2]。如何高效利用低值魚蛋白是目前水產(chǎn)品加工領(lǐng)域亟待解決的問題。

pH 調(diào)節(jié)法是一種基于等電點(diǎn)沉淀的蛋白分離技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域[3-5]。近年來，蛋白分離技術(shù)越來越多地用于開發(fā)水產(chǎn)蛋白源[6-8]。以鯉魚為研究對象，探討pH 調(diào)節(jié)法對大宗低值淡水魚蛋白的分離特性。前期研究結(jié)果[9]表明pH 2.5 溶出-pH 5.5 沉淀可以回收76.30%的鯉肌肉蛋白，pH 12.5 溶出-pH 5.5 沉淀可以回收87.56%的魚肉蛋白。該方法不僅能有效回收鹽溶性肌原纖維蛋白，還能回收一部分水溶性蛋白。分離蛋白氨基酸組成合理，而且具有比魚肉更好的消化特性，胰凝乳蛋白酶的消化速率提高了7～8倍。pH 調(diào)節(jié)過程中，極端的酸堿環(huán)境會導(dǎo)致魚肉蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而對功能性產(chǎn)生影響。Kristinsson 等[10]研究了0.6 mol/L KCl 條件下，pH 2.5 和pH 11 以及再調(diào)至pH 7.5 過程中鱈魚肌球蛋白空間構(gòu)象的變化。而對分離蛋白是先添加純水再調(diào)節(jié)pH 制備的，該過程并未添加鹽離子。本研究通過極低離子強(qiáng)度 （0.05 mol/L KCl）下，調(diào)節(jié)pH 過程中鯉肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性、α 螺旋含量、內(nèi)源熒光強(qiáng)度、巰基含量、表面疏水性等指標(biāo)的變化，探討肌球蛋白空間構(gòu)象改變規(guī)律，為大宗低值魚蛋白制備技術(shù)體系的建立和新型功能性分離魚蛋白的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活鯉魚購買于大連沃爾瑪超市。運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室立刻速殺，去頭、內(nèi)臟、鱗、鰭、鰓，然后清洗、去皮、去骨、采肉、放入斬拌料理機(jī)中絞碎成肉泥狀，放置于冰浴條件下備用。

三磷酸腺苷二鈉，鹽酸胍，8-苯胺基-1-萘磺酸，美國Sigma 公司；KCl，CuSO4，NaOH，Tris，三氯乙酸等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Z326K 高速冷凍離心機(jī)，德國HERMLE 公司；J-715 熒光分光光度計(jì)，日本分光株式會社；AE-6500 平板電泳槽，日本ATTO 株式會社；HG-200 高速分散均質(zhì)機(jī)，日本HSIANGTAI；J-725 圓二色譜儀，日本分光株式會社。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的純化 肌球蛋白的提取參照Kato 和Konno[11]的方法進(jìn)行，絞碎的鯉魚肉中加入10 倍體積預(yù)冷的0.1 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）攪勻，4 ℃，5 000 g 離心5 min，取沉淀重復(fù)上述操作3 次。將收集的沉淀懸濁于上述緩沖液中，13 000 r/min 組織均質(zhì)2～3 次，每次間隔30 s。然后離心（5 000 g，10 min，4 ℃），收集沉淀。沉淀漂洗3 次后，懸濁于0.1 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液中，經(jīng)兩層紗布過濾所得濾液為肌原纖維蛋白。用3 mol/L KCl 將肌原纖維蛋白溶液的鹽濃度調(diào)至0.5 mol/L，加入2 mmol/L Mg-ATP，然后加入硫酸銨粉末至飽和度40%，靜止30 min 離心收集上清，再將上清液中硫酸銨飽和度調(diào)至50%，離心所得沉淀溶解于0.5 mol/L KCl-20 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）中，透析除硫酸銨。最后離心（12 000 g，20 min，4 ℃）所得溶液即為鯉肌球蛋白。

1.3.2 鯉肌球蛋白的酸堿處理 加水調(diào)節(jié)肌球蛋白的鹽濃度至0.05 mol/L。分別加入0.05 mol/L HCl 或者0.05 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)肌球蛋白溶液的pH 至2.5，3.5，11.5，12.5，處理1 h 后用于后續(xù)分析。同時(shí)以溶解于0.5 mol/L KCl 20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖溶液和經(jīng)過6 mol/L 鹽酸胍（變性劑）處理的肌球蛋白溶液作為對照。所有操作均在0 ℃下進(jìn)行。

1.3.3 肌球蛋白溶解性變化 加水調(diào)節(jié)肌球蛋白鹽濃度0.05 mol/L，蛋白質(zhì)量濃度至3 mg/mL。經(jīng)過上述pH 處理1 h 后，離心（10 000 g，10 min，4℃）收集上清液，用雙縮脲法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。另外pH 處理1 h-調(diào)回pH 7.5 后再次測定上清蛋白濃度。按照以下公式計(jì)算pH 調(diào)節(jié)過程中肌球蛋白溶解度變化。溶解度（%）=[（上清液蛋白濃度×體積）/（處理前體積×3 mg/mL）]×100

1.3.4 肌球蛋白 Ca2+-ATPase 活性 按照THAVAROJ 等的方法[12]測定ATPase 酶活，1.0 mg/mL 肌球蛋白樣液經(jīng)過上述酸堿處理后，取0.1 mL 加入到0.9 mL 反應(yīng)液中（含有1 mmol/L ATP，5 mmol/L CaCl2和25 mmol/L Tris-馬 來 酸（pH 7.0）），在20 ℃反應(yīng)0，2，5，10，15，20，25，30 min后，加入15%高氯酸溶液終止反應(yīng)。采用鉬酸銨法[9]測定反應(yīng)中釋放的無機(jī)磷（Pi）含量來確定Ca2+-ATPase 活性的變化，酶活性單位為：μmol Pi/mg·min。

1.3.5 圓二色譜（CD）分析 配制0.5 mg/mL 肌球蛋白樣液（含0.05 mol/L KCl），在冰水浴中pH 處理1 h，然后經(jīng)20 000 g，20 min 離心取上清進(jìn)行圓二色譜分析。圓二色譜儀各參數(shù)設(shè)置為：溫度4℃，波長掃描范圍為190～250 nm，分辨率為0.2 nm，縫寬為4 nm，靈敏度為20 mdeg，掃描時(shí)間間隔和掃描速度分別為1 s 和100 mdeg/min。

1.3.6 色氨酸熒光分析 樣品處理按照CD 分析進(jìn)行同樣處理，使用Jasco J-715 熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長297 nm，光譜范圍為300～400 nm對各樣品進(jìn)行熒光掃描，狹縫寬度為5 nm。

1.3.7 表面疏水性測定 采用ANS （8-苯胺基-1-萘磺酸）探針[10]檢測表面疏水性的變化。向鯉肌球蛋白溶液（0.5 mg/mL）中加入20 μL 的ANS 溶液 （8.0 mmol/L，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4）振蕩，靜置15 min（避光），使用熒光分光光度計(jì)測定樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。試驗(yàn)中，ANS 熒光探針檢測的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為390 nm 和470 nm，狹縫寬均為5 nm。減去各樣品溶液未加探針時(shí)的熒光強(qiáng)度即為每種蛋白的相對熒光強(qiáng)度值（RFI）。以相對熒光強(qiáng)度對蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)。

1.3.8 總巰基含量測定 總巰基的測定參考Benjakul[13]的方法，分別取蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL（含0.05 mol/L KCl）的經(jīng)酸堿處理的肌球蛋白樣液0.5 mL，加入2 mL 20 mmol/L Tris-HCl （pH 7.5）緩沖液（含有8 mol/L 尿素，10 mmol/L EDTA，2% SDS），溫度控制在4 ℃下。然后加入50 μL 0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液 （10 mmol/L DNTB，pH 7.2），40 ℃反應(yīng)25 min，412 nm 比色，空白用20 mmol/L 的含0.6 mol/L KCl 的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）。巰基含量按下式計(jì)算：

巰基含量（mol·10-5·g-1）=式中：A——吸光值；D——釋釋倍數(shù)；B——蛋白質(zhì)量濃度 （mg/mL）；C——吸光系數(shù)13 600（mol-1·cm-1·L）。

1.3.9 肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化特性 根據(jù)Kato 和Konno 方法[11]，配制3 mg/mL（含0.05 mol/L KCl）酸堿處理的肌球蛋白樣品，將pH 調(diào)解至7.0后，加入1 mmol/L EDTA 攪拌均勻并在20 ℃水浴條件下預(yù)熱2 min，使用質(zhì)量比1/500 胰凝乳蛋白酶在20 ℃水浴條件下分別消化0，5，10，20，40，60 min。然后取0.2 mL 分別加入1 mmol/L PMSF 和0.1 mL 電泳上樣液，充分混勻后在100 ℃下煮沸5 min。用7.5% SDS-PAGE 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌球蛋白的分離純化

通過圖1的SDS-PAGE 結(jié)果可知，在200 ku出現(xiàn)的條帶為肌球蛋白重鏈，在20.1～14.3 ku 出現(xiàn)的條帶為肌球蛋白輕鏈。分子質(zhì)量約44 ku 的肌動蛋白殘留量很少，肌球蛋白的純度可達(dá)85%。

2.2 肌球蛋白的溶解性變化

pH 處理對鯉肌球蛋白溶解性的影響如圖 2所示，在酸性pH（2.5 和3.5）和堿性pH（11.5 和12.5），肌球蛋白的溶解性較高，均達(dá)到90%左右。經(jīng)pH 變換處理后再調(diào)至pH 7.5 時(shí)，溶解度顯著下降，并且初始pH 值越高，溶解度下降越明顯。肌球蛋白是鹽溶性蛋白，在0.05 mol/L KCl 條件下溶解度很低，需要一定的離子強(qiáng)度才能促進(jìn)其溶解[14]。蛋白質(zhì)的溶解性與蛋白質(zhì)分子大小和表面電荷有關(guān)[15]。在極端pH 條件下，肌球蛋白分子帶有較多的凈正電荷或凈負(fù)電荷，分子由于靜電排斥作用趨于解離，因而溶解度增加。并且愈是偏離等電點(diǎn)，蛋白分子表面凈電荷愈多，蛋白溶解度愈高[16]。通過對肌球蛋白的溶解性的研究也進(jìn)一步證實(shí)了在分離蛋白制備的過程中，極端pH 條件下肌球蛋白回收率很高。將極端pH 調(diào)回中性7.5 時(shí)，溶解度均顯著下降，這是由于在低離子強(qiáng)度鹽濃度下，靠近肌球蛋白的等電點(diǎn)，蛋白分子與水之間的作用被蛋白之間的作用力所取代，減少了分子間靜電排斥作用，導(dǎo)致溶解度降低。同樣的結(jié)果在其他魚類如鱈魚肌原纖維[17]、鮭魚肌球蛋白[18]、巖魚[19]等研究中也有報(bào)道，并與Park 等[20]研究不同離子強(qiáng)度和pH 對鮭魚肌球蛋白的溶解性和構(gòu)象變化的影響結(jié)果一致。

圖1 鯉肌球蛋白的電泳分析Fig.1 SDS-PAGE patterns of myosin from common carp muscle

2.3 肌球蛋白的Ca2+-ATPase 活性變化

圖2 pH 調(diào)節(jié)對鯉魚肌球蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of pH shift on solubility of myosin from common carp muscle

以0.5 mol/L KCl，pH 7.5 的條件下測定的肌球蛋白Ca2+-ATPase 作為100，在0.05 mol/L KCl，pH 2.5，3.5，11.5，12.5 進(jìn)行酸堿處理后，未能檢測到Ca2+-ATPase 活性。即使再調(diào)節(jié)到pH 7.5 也未能檢測到Ca2+-ATPase 活性，結(jié)果如表1所示。由于肌球蛋白的球狀頭部具有ATPase 的活性，因此，可用Ca2+-ATPase 活性來評價(jià)肌球蛋白頭部構(gòu)象的變化[21]。肌球蛋白在極端酸性pH（2.5，3.5）和極端堿性pH（11.5，12.5），Ca2+-ATPase 活性為零，可能是由于經(jīng)極端pH 處理后鯉肌球蛋白頭部完全變性展開，空間構(gòu)象發(fā)生了變化。調(diào)回pH 7.5后，Ca2+-ATPase 活性仍為零。由此推測經(jīng)pH 處理后，肌球蛋白球狀頭部的構(gòu)象并未得到恢復(fù)，空間構(gòu)象的改變是不可逆的。

表1 pH 調(diào)節(jié)對鯉魚肌球蛋白的Ca2+-ATPase活性的影響Table 1 Effect of pH-shift on ATPase activity of common carp myosin

2.4 肌球蛋白的α 螺旋含量變化

pH 處理對肌球蛋白α 螺旋結(jié)構(gòu)的影響如圖3所示，與肌球蛋白（pH 7.5）相比，經(jīng)極端pH 處理的肌球蛋白在222 nm 處的負(fù)峰的大小基本沒有變化。經(jīng)過6 mol/L 鹽酸胍變性處理的樣品的負(fù)峰完全消失，由此推測α 螺旋的含量幾乎沒有發(fā)生變化。肌球蛋白的α 螺旋結(jié)構(gòu)主要存在于棒狀的尾部，因此可認(rèn)為pH 調(diào)節(jié)未造成肌球蛋白尾部的二級結(jié)構(gòu)的破壞。與Kristinsson 等[22]在對鱈魚肌球蛋白進(jìn)行pH 處理后二級結(jié)構(gòu)并未發(fā)生改變的結(jié)論是一致的。Konno 等[12]研究認(rèn)為肌球蛋白的溶解性主要與桿狀尾部的結(jié)構(gòu)有關(guān)，也證明了分離蛋白可保持良好溶解性。

圖3 pH 調(diào)節(jié)后肌球蛋白CD 圖譜的變化Fig.3 Effect of pH on Far-UV circular dichroism spectra

2.5 肌球蛋白的色氨酸熒光分析

肌球蛋白是由兩個(gè)球狀頭部和一個(gè)棒狀尾部組成[21]，且肌球蛋白頭部和棒狀尾部均含有大量的色氨酸殘基。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸為蛋白內(nèi)源生色基團(tuán)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)熒光強(qiáng)度發(fā)生降低或增強(qiáng)，最大吸收峰發(fā)生紅移或藍(lán)移，這種變化可用來衡量蛋白質(zhì)分子發(fā)生去折疊的程度，進(jìn)而反映蛋白的三級結(jié)構(gòu)的變化。圖4結(jié)果表明，pH 7.5 時(shí)色氨酸的最大熒光波長在340 nm 左右。經(jīng)堿性pH 處理后，肌球蛋白色氨酸的熒光光譜發(fā)生了顯著變化，色氨酸與溶劑分子發(fā)生熒光淬滅，且顯著紅移（349 nm）。而酸性條件下肌球蛋白無明顯的熒光淬滅，最大熒光波長仍為340 nm。RAGHAVAN 等[22]報(bào)道了在6 mol/L 的胍鹽酸中完全展開的肌球蛋白分子大部分色氨酸熒光淬滅且顯著紅移（350 nm）。據(jù)此推測堿性pH 處理后，肌球蛋白色氨酸殘基暴露程度更高，肌球蛋白展開變性程度更大。而極端酸性pH 處理后，色氨酸殘基暴露幾乎沒有發(fā)生變化。

2.6 肌球蛋白的表面疏水性

圖4 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的色氨酸熒光光譜Fig.4 Effect of pH on emission fluorescence spectra of denaturation myosin

蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)主要靠疏水鍵作用來維持。ANS 是一種對極性敏感的陰離子型熒光探針，在蛋白質(zhì)疏水性測定中容易受到靜電作用力的干擾。不僅與天然的或完全變性的蛋白質(zhì)分子相互作用，且與不完全變性的蛋白質(zhì)分子的疏水性基團(tuán)產(chǎn)生更強(qiáng)的相互作用力，而使表面疏水性顯著增加。圖5結(jié)果表明，相比于pH 7.5 條件下，經(jīng)酸處理的肌球蛋白ANS-S0 顯著升高。而在堿性條件下，ANS-S0 幾乎沒有發(fā)生變化。肌球蛋白在酸、堿或高離子環(huán)境中，蛋白分子表面分別帶凈正電荷或凈負(fù)電荷，在靜電排斥作用下，蛋白質(zhì)分子展開，使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)和殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面，從而使ANS-S0 提高。但酸性（pH 2.0，3.5）條件下肌球蛋白的表面疏水性明顯高于堿性條件（pH 11.5，12.5）的。這可能是由于酸處理時(shí)用HCl 調(diào)節(jié)pH，這其中的陰離子Cl-能使肌球蛋白溶液產(chǎn)生促溶效應(yīng)[22]，使得肌球蛋白在HCl 的酸性環(huán)境中變性更加嚴(yán)重。由此推斷，pH 調(diào)解法生產(chǎn)分離蛋白時(shí)，魚肉經(jīng)過酸堿處理后，會對肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，酸處理的影響可能更大。

2.7 肌球蛋白的巰基含量

圖5 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的表面疏水性Fig.5 Effect of pH on the surface hydrophobicity of myosin from common carp

二硫鍵對維持蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象和穩(wěn)定性有重要作用，也是蛋白質(zhì)熱處理形成凝膠過程中必不可少的過程[23]。巰基含量的多少反應(yīng)二硫鍵形成情況。圖6結(jié)果顯示，pH 調(diào)節(jié)處理后，肌球蛋白巰基含量變化不大。肌球蛋白分子中有大約42 個(gè)巰基，約有24 或26 個(gè)在球狀頭部，每條堿性輕鏈中各有一個(gè)，每個(gè)DTNB 輕鏈中有2 個(gè)。其中一部分活性巰基基團(tuán)存在于蛋白質(zhì)分子表面，一部分包裹在肌球蛋白棒狀尾部中[24]。與試驗(yàn)中的凝膠性結(jié)果一致，分離蛋白和新鮮魚肉的凝膠性幾乎沒有差別。

2.8 肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化特性

pH 調(diào)節(jié)處理后肌球蛋白的消化模式發(fā)生了顯著的變化，如圖7所示，在pH 7.5（0.05 mol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA）的條件下，肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)主要發(fā)生在頭部S-1 以及尾部rod[11]。而經(jīng)過pH 調(diào)節(jié)后，無論酸性pH 處理還是堿性pH 都未觀察到S-1 條帶，說明酶切位點(diǎn)發(fā)生了變化。此外，經(jīng)過酸處理之后，MHC 的消失效率比pH 7.5 提高了大約3 倍。堿處理后也略有提高，進(jìn)一步說明了肌球蛋白的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。

圖6 肌球蛋白經(jīng)pH 調(diào)節(jié)后的巰基含量Fig.6 Effect of pH on the sulfhydryl group contents of myosin from common carp

圖7 pH 調(diào)節(jié)對肌球蛋白的胰凝乳蛋白酶消化位點(diǎn)的影響Fig.7 Effect of pH-shift on digestion site of myosin by α-chymotrypsin

3 結(jié)論

在極低離子強(qiáng)度（0.05 mol/L KCl）條件下，鯉肌球蛋白經(jīng)過pH 調(diào)節(jié)后，α 螺旋含量沒有發(fā)生變化，說明pH 調(diào)節(jié)未引起二級結(jié)構(gòu)的改變。球狀頭部的Ca2+-ATPase 活性喪失，胰凝乳蛋白酶酶切位點(diǎn)變化，均說明肌球蛋白三級結(jié)構(gòu)遭到了破壞。但是，堿性pH 造成色氨酸殘基暴露程度更高，酸性pH 導(dǎo)致疏水性基團(tuán)暴露更多，也反映出酸堿pH調(diào)節(jié)導(dǎo)致的三級結(jié)構(gòu)的改變存在差異。