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    雨生紅球藻源蝦青素酯的消化吸收特性研究

    2019-05-18 06:13:36周慶新
    中國食品學報 2019年4期
    關鍵詞:游離態(tài)青素灌胃

    周慶新 楊 魯 徐 杰

    (1日照職業(yè)技術學院海洋工程學院 山東日照276816 2 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島266003)

    蝦青素是一類非維生素A 源脂溶性類胡蘿卜素,其在動物體內不能被合成,須從食物中攝取。美國食品和藥物管理局(FDA)禁止化學合成蝦青素作為膳食補充劑用于食品生產,批準其作為著色劑在動物及水產飼料和日化領域中使用,歐盟委員會批準天然蝦青素作為食品著色劑在食品行業(yè)應用[1]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認為天然蝦青素的良好來源。其中蝦青素主要以與脂肪酸鏈接形成的蝦青素酯形式存在,且蝦青素酯的脂肪酸鏈分子組成復雜多樣[2]。傳統(tǒng)利用雨生紅球藻制備天然游離蝦青素的方法主要有化學皂化法和生物酶解法[3],而在制備過程中主要面臨兩個難題:第一,由于蝦青素分子結構中含有大量的不飽和雙鍵和羰基,所以其化學性質極其不穩(wěn)定,使蝦青素酯在皂化過程中易產生大量的副產物——蝦紅素及半蝦紅素[4];第二,生物酶法制備游離蝦青素雖然過程條件溫和,利于保持蝦青素的穩(wěn)定,但其轉化率較低,使生產成本較高[5]。有學者將水解制備游離蝦青素視為蝦青素行業(yè)發(fā)展的關鍵限制因素,只有解決這些問題,整個蝦青素的產業(yè)鏈才會向前發(fā)展。

    面對這一問題,做出如下思考:在開發(fā)蝦青素功能性產品的過程中,首先要解決的問題便是功能因子的選擇,如果經過水解過程,直接將蝦青素酯作為功能因子用于食品或藥品行業(yè),其能否在體內發(fā)揮與游離蝦青素相同的生物學功能? 為探究這一問題,先要明確蝦青素酯在體內的吸收代謝機制。Coral 等[6]研究表明,人體在口服攝入蝦青素酯后,在血清中只檢測到游離態(tài)蝦青素,據此推測蝦青素酯是在消化道內發(fā)生水解轉化為游離蝦青素后被吸收的,這一研究為蝦青素酯在體內發(fā)揮與游離態(tài)蝦青素相同的生物學效價提供了證據,然而缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據,來證明這一推測的準確性。研究蝦青素酯在體內的消化吸收特性對蝦青素功能因子的選擇及產品運載系統(tǒng)設計具有重要意義。

    鑒于此,本文以純化制備的雨生紅球藻來源蝦青素酯為原料,選取Balb/c 小鼠作為動物模型,系統(tǒng)研究蝦青素酯在模型小鼠消化道內的消化、排泄和吸收情況,為評價雨生紅球藻源蝦青素酯作為功能因子的可行性提供科學的數(shù)據。

    1 材料與儀器

    1.1 原料與試劑

    新鮮破壁雨生紅球藻粉(總蝦青素含量2%),荊州天然蝦青素有限公司;全反式蝦青素標準品(all-trans-astxanthin),純度為(95.8±0.5)%,德國Dr.Ehrenstorfer 公司;色譜純甲基叔丁基醚(MBTE),Burdick & Jackson (美國Muskegon 公司生產);甲醇(色譜純),德國Merck 公司;乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己烷(均為國產分析純級),國藥集團化學試劑有限公司;玉米油 (脂肪酸組成:15%飽和脂肪酸,30.8%單不飽和脂肪酸,54.1%多不飽和脂肪酸),山東西王食品有限公司;小鼠基礎飼料,北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

    1.2 主要儀器

    Millipore Q 純水機,美國Millipore 公司;MS 3B-S25 型電動高速勻漿器,德國IKA 公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;CP100MX型高速冷凍離心機,日本日立公司;SD-50 型制冰機,上海雪人機電設備有限公司;DW-86L486 型立式超低溫保存箱,青島海爾特種電器有限公司;N-EVAP1 12 氮吹儀,美國Organomation Associates 公司;1260 型液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD)、G6410B 三重四極桿質譜儀、 大氣壓化學電離源(APCI),美國Agilent 公司;KQ-300E 超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司。

    1.3 色譜柱

    YMC-Carotenoid-C30 色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),日本YMC 株式會社。

    1.4 實驗動物

    雄性Balb/c 小鼠,SPF 級,體質量(22±2)g,購自青島市藥檢所。

    2 試驗方法

    2.1 雨生紅球藻蝦青素酯的制備

    參照文獻[7]報道方法,以新鮮破壁雨生紅球藻粉為原料,制備純化蝦青素酯。制備方法:稱取一定量的新鮮雨生紅球藻藻粉,加入20 倍體積的乙酸乙酯,在4 ℃、避光、充氮條件下振蕩提取10 min,然后4 ℃、5 000 r/min 離心5 min,收集上清液;剩余藻粉重復提取3 次,合并提取液;提取液于25 ℃條件下真空旋轉蒸發(fā)至無液體流出,得到蝦青素酯粗提物;稱取100 g 已活化硅膠,采用濕法上柱,用約3~4 倍柱體積正己烷壓實硅膠柱,將前述得到的蝦青素酯粗提物用正己烷重新溶解后上樣,然后依次用正己烷∶丙酮(100 ∶0→96 ∶4→92 ∶9→88∶12,體積比)進行洗脫純化,并利用薄層層析(TLC)和HPLC 對洗脫組分進行檢測,最后將蝦青素單酯和雙酯組分合并,合并后的洗脫液在25 ℃條件下真空旋轉蒸發(fā)至無液體流出,得到純化蝦青素酯,并利用HPLC-MS 對其分子種組成及純度進行檢測分析。結果表明,制備得到的純化蝦青素酯純度為(96.8±1.2)%,其中粗提物和純化蝦青素酯的分子種組成如表1所示。

    2.2 蝦青素酯灌胃液的制備

    準確稱量(0.01 mg)一定量的純化蝦青素酯,將其分散于適量的玉米油中,在冰浴和氮氣保護下超聲波振蕩5 min,使其分散均勻,按照灌胃劑量配制成相應蝦青素當量濃度的灌胃液。

    2.3 蝦青素酯在小鼠消化道內消化過程的測定

    2.3.1 動物分組及灌胃 試驗小鼠按照體質量隨機分為8 組,分別對應消化過程的8 個時間點,每組5 只小鼠。飼料和水自由攝取,適應喂養(yǎng)一周,實驗前,禁食不禁水10 h。各試驗組小鼠按照30 mg/kg·體質量(蝦青素當量)的劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃2.2 節(jié)方法制備的蝦青素酯玉米油,灌胃結束后正常進食進水。分別于灌胃0,3,5,7,9,12,17,24 h 后處死小鼠,處死后取完整消化道,按照胃、小腸、大腸進行分段,并分別用2 mL 生理鹽水沖洗消化道內容物,合并內容物收集于10 mL 離心管中,凍于-80 ℃保存;然后將不同消化道區(qū)段剖開,分別用生理鹽水刮洗干凈,洗凈的消化道區(qū)段分別包好,液氮速凍后于-80 ℃保存。

    2.3.2 不同區(qū)段消化道壁中蝦青素組成分析 參考Matyash 等[8]公布的利用MTBE 提取生物樣本中脂質的方法,提取消化道壁中的總蝦青素類化合物,并優(yōu)化:將樣品置于具塞玻璃離心管中,加入300 μL 甲醇,渦旋1 min,加入1 mL MTBE,在冰浴條件下以8 000 r/min 轉速勻漿5 min,勻漿后靜置10 min,加入250 μL 超純水,渦旋30 s,再次靜置10 min,于4 ℃,8 000 r/min 條件下離心5 min,離心后用移液槍小心吸取上層有機相,置于另一具塞玻璃離心管中,原離心管下層加入400 μL 混合液重復提取,混合液組分與上層相同(配制方法:配制MTBE∶甲醇∶水(10 ∶3 ∶2.5,體積比)的混合液,靜置分層后,取上層),提取完全后,合并上層有機相,并用氮氣吹干,吹干后再用1 mL的MTBE ∶甲醇(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm濾膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于-20 ℃保存,3 d內進行HPLC 分析,試驗過程盡量避光操作。

    表1 雨生紅球藻粗提物和純化蝦青素酯的質譜分析結果和各組分相對含量Table1 Mass spectroscopy data and the relative contents of astaxanthin and esterified astaxanthins in the H.pluvialis extract and purified esterified astaxanthins

    2.3.3 消化道內容物中蝦青素組成分析 消化道內容物經凍干后,研磨并充分混合均勻,然后稱取60 mg 于10 mL 玻璃離心管中,加入3 mL 氯仿∶甲醇溶液(2 ∶1,體積比),渦旋5 min,靜置10 min,6 000 r/min 離心5 min,離心后小心吸取上層有機相,重復提取3 次,合并提取液,氮氣吹干,吹干后用1 mL 甲醇∶MBTE(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm 有機膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于3 d 內進行HPLC 分析,試驗過程盡量低溫避光操作。

    2.4 糞便中蝦青素排泄情況的測定

    試驗小鼠按照體重隨機分為2 組,分別為對照組和蝦青素酯組,每組5 只小鼠。飼料和水自由攝取,適應喂養(yǎng)1 周,試驗前,禁食不禁水10 h。蝦青素酯組實驗小鼠按照30 mg/kg·體質量(蝦青素當量)的劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃蝦青素酯玉米油,對照組按照10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃玉米油。灌胃結束后正常進食進水,并分別于灌胃后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h 收集小鼠糞便,真空冷凍干燥,稱量,研磨,-80 ℃冰箱保存;然后按照2.3.3 處理消化道內容物的方法進行萃取處理,利用HPLC 分析其中蝦青素存在形態(tài)及含量。

    2.5 不同腸段、血清和肝臟中蝦青素代謝時間曲線測定

    2.5.1 動物分組及灌胃 實驗小鼠按體質量隨機分為2 大組:對照組和蝦青素酯組,每組45 只,然后每一大組按照對應時間點再隨機分為9 小組。小鼠禁食10 h 后,蝦青素酯組按100 mg/kg·體質量的灌胃劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃蝦青素酯玉米油,對照組按照10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃玉米油。

    分別在灌胃0,5,7,9,12,17,24,48,72 h 后摘眼球取血,置于含EDTA 的離心管中,室溫(25~26 ℃)放置30 min 分層后,在4 ℃、7 500 r/min 條件下離心15 min,用移液槍仔細吸取上層血清,于-80 ℃保存。小鼠處死后,取消化道,并按照十二指腸、空腸、回腸和結腸進行分段,分別用生理鹽水洗凈消化道內容物,然后將不同消化道區(qū)段剖開,分別用生理鹽水刮洗干凈,洗凈后的消化道區(qū)段用濾紙吸干的游離水,稱重,分別包好,凍于-80℃保存。

    2.5.2 不同腸段對蝦青素吸收情況的測定 將2.5.1 節(jié)中收集的不同時間點的腸段按2.3.2 方法進行處理,利用HPLC 測定其中蝦青素的含量,以考察不同腸段對蝦青素的吸收情況。

    2.5.3 血清中蝦青素組成分析 參考Khachik等[9]公布的方法萃取小鼠血清中蝦青素,并根據實際情況進行優(yōu)化,具體操作:取500 μL 血清,加800 μL 甲醇,渦旋30 s,再加入1 500 μL 的氯仿,渦旋30 s,靜置10 min,8 000 r/min 條件下離心3 min,取下相,重復萃取3 次,合并下相溶液,氮氣吹干,再用1 mL 甲醇∶MBTE(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm 有機膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于3 d 內進行HPLC 分析,測定其中蝦青素的含量,試驗過程盡量低溫避光操作。

    2.5.4 肝臟中蝦青素組成分析 肝臟中蝦青素組成分析方法參照2.3.2 方法。

    2.6 數(shù)據處理與分析

    試驗數(shù)據以平均值±SD 表示,采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差one-way ANOVA 分析,并采用Tukey’s 法進行兩兩比較分析,以P<0.05 為顯著水平。

    3 結果與分析

    3.1 蝦青素酯在消化道不同部位的消化吸收過程

    3.1.1 消化道不同部位中蝦青素的存在形態(tài) 圖1描述了灌胃蝦青素酯5 h 后,在小鼠的不同部位消化道壁及其內容物中蝦青素的存在形態(tài)。圖中結果顯示,蝦青素酯在胃內未發(fā)生水解,全部以蝦青素酯的形式存在;而在小腸和大腸內容物中檢測到了大量游離態(tài)蝦青素,而蝦青素酯的相對含量顯著下降,說明蝦青素酯在小腸內被消化酶水解成游離態(tài)蝦青素;糞便中蝦青素酯的含量相對較高,說明有大量蝦青素酯在消化道內未被酶解,即被排出體外,進而無法被生物體吸收利用。據此推斷,蝦青素酯在消化道內的酶解效率可能是影響其在生物體內利用度的重要因素。另外,不同部位消化道壁中蝦青素的分析結果顯示,在胃壁中未檢測到蝦青素,而在小腸和大腸中均檢測到游離蝦青素,而未檢測到酯化態(tài)蝦青素,該結果進一步證明了蝦青素酯進入體內后是以游離態(tài)蝦青素的形式被生物體吸收利用。在上述試驗結果的基礎上,推測蝦青素酯在小鼠體內消化吸收過程中分子形態(tài)的變化如圖2所示。據文獻報道[10-11],葉黃素酯同樣作為一類自然界存在的酯化態(tài)類胡蘿卜素,其在大鼠體內的消化水解過程與本研究結果一致,目前認為葉黃素酯在體內水解為葉黃素是一個自然的生理過程。

    圖1 消化道不同部位中蝦青素及其酯的HPLC-DAD 分離譜圖Fig.1 The molecular speciation of astaxanthin in different part of digestive tract

    圖2 蝦青素酯在小鼠體內消化過程中形態(tài)變化Fig.2 The changes of esterified astaxanthins form during digestion in mice

    3.1.2 不同腸段對蝦青素的吸收效應 本試驗考察了模型小鼠在灌胃蝦青素酯后,不同腸段對蝦青素的吸收情況,結果如圖3所示。從圖中可以看出,蝦青素在十二指腸、空腸、回腸中均有吸收,由濃度-時間曲線下面積可知,蝦青素在空腸腸段被吸收的量最高,在結腸中的吸收量較小,且吸收量顯著低于其它腸段中蝦青素的吸收量 (P<0.05)。故推測,蝦青素在消化道內主要是在小腸腸段被吸收,且以空腸為主要吸收場所,同時有少量在大腸部位被吸收。該結論與目前已報道[12]類胡蘿卜素的吸收相一致。

    圖3 不同腸段中蝦青素濃度-時間曲線Fig.3 The content-time curve of astaxanthin in different intestine segments after gavage

    3.1.3 消化道內容物中蝦青素含量及組成變化為進一步明確蝦青素酯在小鼠體內的消化水解過程,該部分考察了灌胃蝦青素酯后,不同時間點消化道內容物中蝦青素的組成情況。由表2可知,小鼠經口灌胃蝦青素酯后,在3 h 時,消化道內容物中游離態(tài)蝦青素的相對含量開始緩慢上升,推測此時灌胃樣品中的蝦青素酯進入小腸,在小腸內開始發(fā)生水解;隨后蝦青素酯開始大量水解,游離蝦青素的相對含量不斷升高。另外,根據圖4所示的不同形態(tài)蝦青素相對含量隨時間的變化情況,推測7~12 h 是蝦青素酯在模型小鼠體內消化水解的高峰期,17 h 后,游離態(tài)蝦青素的相對含量變化緩慢,至24 h 時,游離態(tài)蝦青素的相對含量略微下降,而蝦青素單酯的含量略微上升,此現(xiàn)象可能由于24 h 時蝦青素在消化道內已基本排空,其中總蝦青素含量較低,在HPLC-DAD 譜圖中難以積分,從而造成一定的試驗誤差。另外需要注意的是,由于游離態(tài)蝦青素和蝦青素酯在消化道內可能會發(fā)生降解,而研究報道[13-14],酯化態(tài)類胡蘿卜素與游離態(tài)類胡蘿卜素在穩(wěn)定性方面存在差異,故蝦青素類化合物在消化道內的降解亦會表現(xiàn)出差異性。因此,試驗測得的不同蝦青素組分相對百分含量應是消化道內酶解和失穩(wěn)降解兩方面共同作用的結果。

    3.2 小鼠糞便中蝦青素含量和組成變化

    由表3可知,小鼠經口灌胃蝦青素酯后,在0~2 h 糞便中無蝦青素類化合物排出,隨后糞便中游離態(tài)蝦青素的相對含量開始上升,直至18 h后,糞便中的游離蝦青素相對含量趨于穩(wěn)定。另外,通過考察模型小鼠糞便中總蝦青素類化合物在HPLC-DAD 圖中的峰面積隨時間的變化情況(圖5)。結果表明:一方面,灌胃蝦青素酯試驗組小鼠在糞便中出現(xiàn)最大總蝦青素排泄量的時間為14 h,至24 h 時幾乎無蝦青素類化合物檢出。通過與3.1.3 試驗結果比較,灌胃蝦青素酯后,消化道內的不同形態(tài)蝦青素組成隨時間的變化趨勢幾乎一致。該部分試驗結果為后續(xù)評價蝦青素酯和游離蝦青素生物可接受率試驗中糞便收集時間提供參考依據。

    表2 小鼠消化道內容物中蝦青素組成變化(n=5)Table2 The changes of astaxanthin’s composition for digestive tract in mice (n=5)

    圖4 灌胃蝦青素酯后消化道內容物中蝦青素形態(tài)變化(n=5)Fig.4 The changes of astaxanthins’s form fordigestive tract in mice after gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    圖5 灌胃蝦青素酯后糞便中的總蝦青素峰面積-時間曲線(n=5)Fig.5 The content-time curve of total astaxanthin in excrement after gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    表3 糞便中蝦青素組成變化(n=5)Table3 The changes of astaxanthins in excrement (n=5)

    3.3 蝦青素酯在小鼠血清和肝臟中的代謝動力學研究

    圖6 灌胃蝦青素酯后血清和肝臟中蝦青素的質量濃度變化(n=5)Fig.6 The change of astaxanthin mass concentration in plasma and liver after oral gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    試驗小鼠在灌胃蝦青素酯后,在血清和肝臟中僅檢測到游離蝦青素,進一步說明蝦青素酯進入小鼠體內后是以游離態(tài)蝦青素的形式被生物體利用,該結論符合Coral 等[6]的研究報道。模型小鼠血清和肝臟中蝦青素質量濃度隨時間變化曲線如圖6所示,灌胃后,小鼠血清和肝臟中的蝦青素質量濃度明顯上升,且變化趨勢近似,均在12 h 時蝦青素質量濃度達到最高峰值(Cmax),分別為0.215 μg/mL 和0.727 μg/mL;在隨后的12~72 h,蝦青素在血清和肝臟中的質量濃度逐漸下降。通過對比蝦青素在血清和肝臟中的最大積累濃度發(fā)現(xiàn),蝦青素在肝臟中的積累濃度顯著高于在血液中的積累濃度,兩者最大吸收濃度相差約3 倍。試驗結果表明,蝦青素酯在模型小鼠體內能以游離蝦青素的形式發(fā)揮作用。據報道[15-18],類胡蘿卜素生物利用率受到化合物結構形式、 在生物體內的結合方式、溶解度、食品基質等因素的影響。Breithaupt等[19-20]研究表明,游離態(tài)和酯化態(tài)的葉黃素、辣椒紅素和β-玉米黃質在模型動物小腸吸收方面沒有顯著差異。而有關蝦青素酯和游離蝦青素在生物利用率方面的差異性還未見系統(tǒng)報道,有待進一步研究。

    4 結論

    本文通過體內動物實驗,研究了蝦青素酯在小鼠體內的消化吸收過程。結果表明:蝦青素酯在模型動物小腸內先被水解轉化成游離蝦青素,然后以游離態(tài)的形式被消化道壁細胞吸收;蝦青素的吸收部位主要在小腸,在胃中無吸收,在大腸(結腸)中被少量吸收,試驗發(fā)現(xiàn)不同腸段對蝦青素的吸收能力從高到低依次為:空腸>回腸>十二指腸>結腸;灌胃蝦青素酯后,蝦青素在模型小鼠血液和肝臟中達到最大積累濃度的時間均為12 h,且肝臟中的最大濃度約為血清中的3 倍。本研究闡述了蝦青素酯在體內的消化吸收情況,為下一步研究不同分子形式蝦青素化合物在生物體內生物利用率的差異性奠定了基礎,并為蝦青素酯作為功能因子代替游離蝦青素在食品、 藥品行業(yè)中應用提供了科學依據。

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