• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雨生紅球藻源蝦青素酯的消化吸收特性研究

    2019-05-18 06:13:36周慶新
    中國食品學報 2019年4期
    關鍵詞:游離態(tài)青素灌胃

    周慶新 楊 魯 徐 杰

    (1日照職業(yè)技術學院海洋工程學院 山東日照276816 2 中國海洋大學食品科學與工程學院 山東青島266003)

    蝦青素是一類非維生素A 源脂溶性類胡蘿卜素,其在動物體內不能被合成,須從食物中攝取。美國食品和藥物管理局(FDA)禁止化學合成蝦青素作為膳食補充劑用于食品生產,批準其作為著色劑在動物及水產飼料和日化領域中使用,歐盟委員會批準天然蝦青素作為食品著色劑在食品行業(yè)應用[1]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)被公認為天然蝦青素的良好來源。其中蝦青素主要以與脂肪酸鏈接形成的蝦青素酯形式存在,且蝦青素酯的脂肪酸鏈分子組成復雜多樣[2]。傳統(tǒng)利用雨生紅球藻制備天然游離蝦青素的方法主要有化學皂化法和生物酶解法[3],而在制備過程中主要面臨兩個難題:第一,由于蝦青素分子結構中含有大量的不飽和雙鍵和羰基,所以其化學性質極其不穩(wěn)定,使蝦青素酯在皂化過程中易產生大量的副產物——蝦紅素及半蝦紅素[4];第二,生物酶法制備游離蝦青素雖然過程條件溫和,利于保持蝦青素的穩(wěn)定,但其轉化率較低,使生產成本較高[5]。有學者將水解制備游離蝦青素視為蝦青素行業(yè)發(fā)展的關鍵限制因素,只有解決這些問題,整個蝦青素的產業(yè)鏈才會向前發(fā)展。

    面對這一問題,做出如下思考:在開發(fā)蝦青素功能性產品的過程中,首先要解決的問題便是功能因子的選擇,如果經過水解過程,直接將蝦青素酯作為功能因子用于食品或藥品行業(yè),其能否在體內發(fā)揮與游離蝦青素相同的生物學功能? 為探究這一問題,先要明確蝦青素酯在體內的吸收代謝機制。Coral 等[6]研究表明,人體在口服攝入蝦青素酯后,在血清中只檢測到游離態(tài)蝦青素,據此推測蝦青素酯是在消化道內發(fā)生水解轉化為游離蝦青素后被吸收的,這一研究為蝦青素酯在體內發(fā)揮與游離態(tài)蝦青素相同的生物學效價提供了證據,然而缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據,來證明這一推測的準確性。研究蝦青素酯在體內的消化吸收特性對蝦青素功能因子的選擇及產品運載系統(tǒng)設計具有重要意義。

    鑒于此,本文以純化制備的雨生紅球藻來源蝦青素酯為原料,選取Balb/c 小鼠作為動物模型,系統(tǒng)研究蝦青素酯在模型小鼠消化道內的消化、排泄和吸收情況,為評價雨生紅球藻源蝦青素酯作為功能因子的可行性提供科學的數(shù)據。

    1 材料與儀器

    1.1 原料與試劑

    新鮮破壁雨生紅球藻粉(總蝦青素含量2%),荊州天然蝦青素有限公司;全反式蝦青素標準品(all-trans-astxanthin),純度為(95.8±0.5)%,德國Dr.Ehrenstorfer 公司;色譜純甲基叔丁基醚(MBTE),Burdick & Jackson (美國Muskegon 公司生產);甲醇(色譜純),德國Merck 公司;乙酸乙酯、丙酮、氯仿、正己烷(均為國產分析純級),國藥集團化學試劑有限公司;玉米油 (脂肪酸組成:15%飽和脂肪酸,30.8%單不飽和脂肪酸,54.1%多不飽和脂肪酸),山東西王食品有限公司;小鼠基礎飼料,北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

    1.2 主要儀器

    Millipore Q 純水機,美國Millipore 公司;MS 3B-S25 型電動高速勻漿器,德國IKA 公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;CP100MX型高速冷凍離心機,日本日立公司;SD-50 型制冰機,上海雪人機電設備有限公司;DW-86L486 型立式超低溫保存箱,青島海爾特種電器有限公司;N-EVAP1 12 氮吹儀,美國Organomation Associates 公司;1260 型液相色譜儀、二極管陣列檢測器(DAD)、G6410B 三重四極桿質譜儀、 大氣壓化學電離源(APCI),美國Agilent 公司;KQ-300E 超聲波清洗機,昆山市超聲儀器有限公司。

    1.3 色譜柱

    YMC-Carotenoid-C30 色譜柱 (4.6 mm×250 mm,5 μm),日本YMC 株式會社。

    1.4 實驗動物

    雄性Balb/c 小鼠,SPF 級,體質量(22±2)g,購自青島市藥檢所。

    2 試驗方法

    2.1 雨生紅球藻蝦青素酯的制備

    參照文獻[7]報道方法,以新鮮破壁雨生紅球藻粉為原料,制備純化蝦青素酯。制備方法:稱取一定量的新鮮雨生紅球藻藻粉,加入20 倍體積的乙酸乙酯,在4 ℃、避光、充氮條件下振蕩提取10 min,然后4 ℃、5 000 r/min 離心5 min,收集上清液;剩余藻粉重復提取3 次,合并提取液;提取液于25 ℃條件下真空旋轉蒸發(fā)至無液體流出,得到蝦青素酯粗提物;稱取100 g 已活化硅膠,采用濕法上柱,用約3~4 倍柱體積正己烷壓實硅膠柱,將前述得到的蝦青素酯粗提物用正己烷重新溶解后上樣,然后依次用正己烷∶丙酮(100 ∶0→96 ∶4→92 ∶9→88∶12,體積比)進行洗脫純化,并利用薄層層析(TLC)和HPLC 對洗脫組分進行檢測,最后將蝦青素單酯和雙酯組分合并,合并后的洗脫液在25 ℃條件下真空旋轉蒸發(fā)至無液體流出,得到純化蝦青素酯,并利用HPLC-MS 對其分子種組成及純度進行檢測分析。結果表明,制備得到的純化蝦青素酯純度為(96.8±1.2)%,其中粗提物和純化蝦青素酯的分子種組成如表1所示。

    2.2 蝦青素酯灌胃液的制備

    準確稱量(0.01 mg)一定量的純化蝦青素酯,將其分散于適量的玉米油中,在冰浴和氮氣保護下超聲波振蕩5 min,使其分散均勻,按照灌胃劑量配制成相應蝦青素當量濃度的灌胃液。

    2.3 蝦青素酯在小鼠消化道內消化過程的測定

    2.3.1 動物分組及灌胃 試驗小鼠按照體質量隨機分為8 組,分別對應消化過程的8 個時間點,每組5 只小鼠。飼料和水自由攝取,適應喂養(yǎng)一周,實驗前,禁食不禁水10 h。各試驗組小鼠按照30 mg/kg·體質量(蝦青素當量)的劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃2.2 節(jié)方法制備的蝦青素酯玉米油,灌胃結束后正常進食進水。分別于灌胃0,3,5,7,9,12,17,24 h 后處死小鼠,處死后取完整消化道,按照胃、小腸、大腸進行分段,并分別用2 mL 生理鹽水沖洗消化道內容物,合并內容物收集于10 mL 離心管中,凍于-80 ℃保存;然后將不同消化道區(qū)段剖開,分別用生理鹽水刮洗干凈,洗凈的消化道區(qū)段分別包好,液氮速凍后于-80 ℃保存。

    2.3.2 不同區(qū)段消化道壁中蝦青素組成分析 參考Matyash 等[8]公布的利用MTBE 提取生物樣本中脂質的方法,提取消化道壁中的總蝦青素類化合物,并優(yōu)化:將樣品置于具塞玻璃離心管中,加入300 μL 甲醇,渦旋1 min,加入1 mL MTBE,在冰浴條件下以8 000 r/min 轉速勻漿5 min,勻漿后靜置10 min,加入250 μL 超純水,渦旋30 s,再次靜置10 min,于4 ℃,8 000 r/min 條件下離心5 min,離心后用移液槍小心吸取上層有機相,置于另一具塞玻璃離心管中,原離心管下層加入400 μL 混合液重復提取,混合液組分與上層相同(配制方法:配制MTBE∶甲醇∶水(10 ∶3 ∶2.5,體積比)的混合液,靜置分層后,取上層),提取完全后,合并上層有機相,并用氮氣吹干,吹干后再用1 mL的MTBE ∶甲醇(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm濾膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于-20 ℃保存,3 d內進行HPLC 分析,試驗過程盡量避光操作。

    表1 雨生紅球藻粗提物和純化蝦青素酯的質譜分析結果和各組分相對含量Table1 Mass spectroscopy data and the relative contents of astaxanthin and esterified astaxanthins in the H.pluvialis extract and purified esterified astaxanthins

    2.3.3 消化道內容物中蝦青素組成分析 消化道內容物經凍干后,研磨并充分混合均勻,然后稱取60 mg 于10 mL 玻璃離心管中,加入3 mL 氯仿∶甲醇溶液(2 ∶1,體積比),渦旋5 min,靜置10 min,6 000 r/min 離心5 min,離心后小心吸取上層有機相,重復提取3 次,合并提取液,氮氣吹干,吹干后用1 mL 甲醇∶MBTE(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm 有機膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于3 d 內進行HPLC 分析,試驗過程盡量低溫避光操作。

    2.4 糞便中蝦青素排泄情況的測定

    試驗小鼠按照體重隨機分為2 組,分別為對照組和蝦青素酯組,每組5 只小鼠。飼料和水自由攝取,適應喂養(yǎng)1 周,試驗前,禁食不禁水10 h。蝦青素酯組實驗小鼠按照30 mg/kg·體質量(蝦青素當量)的劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃蝦青素酯玉米油,對照組按照10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃玉米油。灌胃結束后正常進食進水,并分別于灌胃后2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h 收集小鼠糞便,真空冷凍干燥,稱量,研磨,-80 ℃冰箱保存;然后按照2.3.3 處理消化道內容物的方法進行萃取處理,利用HPLC 分析其中蝦青素存在形態(tài)及含量。

    2.5 不同腸段、血清和肝臟中蝦青素代謝時間曲線測定

    2.5.1 動物分組及灌胃 實驗小鼠按體質量隨機分為2 大組:對照組和蝦青素酯組,每組45 只,然后每一大組按照對應時間點再隨機分為9 小組。小鼠禁食10 h 后,蝦青素酯組按100 mg/kg·體質量的灌胃劑量和10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃蝦青素酯玉米油,對照組按照10 mL/kg·體質量的灌胃體積灌胃玉米油。

    分別在灌胃0,5,7,9,12,17,24,48,72 h 后摘眼球取血,置于含EDTA 的離心管中,室溫(25~26 ℃)放置30 min 分層后,在4 ℃、7 500 r/min 條件下離心15 min,用移液槍仔細吸取上層血清,于-80 ℃保存。小鼠處死后,取消化道,并按照十二指腸、空腸、回腸和結腸進行分段,分別用生理鹽水洗凈消化道內容物,然后將不同消化道區(qū)段剖開,分別用生理鹽水刮洗干凈,洗凈后的消化道區(qū)段用濾紙吸干的游離水,稱重,分別包好,凍于-80℃保存。

    2.5.2 不同腸段對蝦青素吸收情況的測定 將2.5.1 節(jié)中收集的不同時間點的腸段按2.3.2 方法進行處理,利用HPLC 測定其中蝦青素的含量,以考察不同腸段對蝦青素的吸收情況。

    2.5.3 血清中蝦青素組成分析 參考Khachik等[9]公布的方法萃取小鼠血清中蝦青素,并根據實際情況進行優(yōu)化,具體操作:取500 μL 血清,加800 μL 甲醇,渦旋30 s,再加入1 500 μL 的氯仿,渦旋30 s,靜置10 min,8 000 r/min 條件下離心3 min,取下相,重復萃取3 次,合并下相溶液,氮氣吹干,再用1 mL 甲醇∶MBTE(1 ∶1,體積比)復溶,經0.22 μm 有機膜過濾,置于棕色樣品瓶中,于3 d 內進行HPLC 分析,測定其中蝦青素的含量,試驗過程盡量低溫避光操作。

    2.5.4 肝臟中蝦青素組成分析 肝臟中蝦青素組成分析方法參照2.3.2 方法。

    2.6 數(shù)據處理與分析

    試驗數(shù)據以平均值±SD 表示,采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差one-way ANOVA 分析,并采用Tukey’s 法進行兩兩比較分析,以P<0.05 為顯著水平。

    3 結果與分析

    3.1 蝦青素酯在消化道不同部位的消化吸收過程

    3.1.1 消化道不同部位中蝦青素的存在形態(tài) 圖1描述了灌胃蝦青素酯5 h 后,在小鼠的不同部位消化道壁及其內容物中蝦青素的存在形態(tài)。圖中結果顯示,蝦青素酯在胃內未發(fā)生水解,全部以蝦青素酯的形式存在;而在小腸和大腸內容物中檢測到了大量游離態(tài)蝦青素,而蝦青素酯的相對含量顯著下降,說明蝦青素酯在小腸內被消化酶水解成游離態(tài)蝦青素;糞便中蝦青素酯的含量相對較高,說明有大量蝦青素酯在消化道內未被酶解,即被排出體外,進而無法被生物體吸收利用。據此推斷,蝦青素酯在消化道內的酶解效率可能是影響其在生物體內利用度的重要因素。另外,不同部位消化道壁中蝦青素的分析結果顯示,在胃壁中未檢測到蝦青素,而在小腸和大腸中均檢測到游離蝦青素,而未檢測到酯化態(tài)蝦青素,該結果進一步證明了蝦青素酯進入體內后是以游離態(tài)蝦青素的形式被生物體吸收利用。在上述試驗結果的基礎上,推測蝦青素酯在小鼠體內消化吸收過程中分子形態(tài)的變化如圖2所示。據文獻報道[10-11],葉黃素酯同樣作為一類自然界存在的酯化態(tài)類胡蘿卜素,其在大鼠體內的消化水解過程與本研究結果一致,目前認為葉黃素酯在體內水解為葉黃素是一個自然的生理過程。

    圖1 消化道不同部位中蝦青素及其酯的HPLC-DAD 分離譜圖Fig.1 The molecular speciation of astaxanthin in different part of digestive tract

    圖2 蝦青素酯在小鼠體內消化過程中形態(tài)變化Fig.2 The changes of esterified astaxanthins form during digestion in mice

    3.1.2 不同腸段對蝦青素的吸收效應 本試驗考察了模型小鼠在灌胃蝦青素酯后,不同腸段對蝦青素的吸收情況,結果如圖3所示。從圖中可以看出,蝦青素在十二指腸、空腸、回腸中均有吸收,由濃度-時間曲線下面積可知,蝦青素在空腸腸段被吸收的量最高,在結腸中的吸收量較小,且吸收量顯著低于其它腸段中蝦青素的吸收量 (P<0.05)。故推測,蝦青素在消化道內主要是在小腸腸段被吸收,且以空腸為主要吸收場所,同時有少量在大腸部位被吸收。該結論與目前已報道[12]類胡蘿卜素的吸收相一致。

    圖3 不同腸段中蝦青素濃度-時間曲線Fig.3 The content-time curve of astaxanthin in different intestine segments after gavage

    3.1.3 消化道內容物中蝦青素含量及組成變化為進一步明確蝦青素酯在小鼠體內的消化水解過程,該部分考察了灌胃蝦青素酯后,不同時間點消化道內容物中蝦青素的組成情況。由表2可知,小鼠經口灌胃蝦青素酯后,在3 h 時,消化道內容物中游離態(tài)蝦青素的相對含量開始緩慢上升,推測此時灌胃樣品中的蝦青素酯進入小腸,在小腸內開始發(fā)生水解;隨后蝦青素酯開始大量水解,游離蝦青素的相對含量不斷升高。另外,根據圖4所示的不同形態(tài)蝦青素相對含量隨時間的變化情況,推測7~12 h 是蝦青素酯在模型小鼠體內消化水解的高峰期,17 h 后,游離態(tài)蝦青素的相對含量變化緩慢,至24 h 時,游離態(tài)蝦青素的相對含量略微下降,而蝦青素單酯的含量略微上升,此現(xiàn)象可能由于24 h 時蝦青素在消化道內已基本排空,其中總蝦青素含量較低,在HPLC-DAD 譜圖中難以積分,從而造成一定的試驗誤差。另外需要注意的是,由于游離態(tài)蝦青素和蝦青素酯在消化道內可能會發(fā)生降解,而研究報道[13-14],酯化態(tài)類胡蘿卜素與游離態(tài)類胡蘿卜素在穩(wěn)定性方面存在差異,故蝦青素類化合物在消化道內的降解亦會表現(xiàn)出差異性。因此,試驗測得的不同蝦青素組分相對百分含量應是消化道內酶解和失穩(wěn)降解兩方面共同作用的結果。

    3.2 小鼠糞便中蝦青素含量和組成變化

    由表3可知,小鼠經口灌胃蝦青素酯后,在0~2 h 糞便中無蝦青素類化合物排出,隨后糞便中游離態(tài)蝦青素的相對含量開始上升,直至18 h后,糞便中的游離蝦青素相對含量趨于穩(wěn)定。另外,通過考察模型小鼠糞便中總蝦青素類化合物在HPLC-DAD 圖中的峰面積隨時間的變化情況(圖5)。結果表明:一方面,灌胃蝦青素酯試驗組小鼠在糞便中出現(xiàn)最大總蝦青素排泄量的時間為14 h,至24 h 時幾乎無蝦青素類化合物檢出。通過與3.1.3 試驗結果比較,灌胃蝦青素酯后,消化道內的不同形態(tài)蝦青素組成隨時間的變化趨勢幾乎一致。該部分試驗結果為后續(xù)評價蝦青素酯和游離蝦青素生物可接受率試驗中糞便收集時間提供參考依據。

    表2 小鼠消化道內容物中蝦青素組成變化(n=5)Table2 The changes of astaxanthin’s composition for digestive tract in mice (n=5)

    圖4 灌胃蝦青素酯后消化道內容物中蝦青素形態(tài)變化(n=5)Fig.4 The changes of astaxanthins’s form fordigestive tract in mice after gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    圖5 灌胃蝦青素酯后糞便中的總蝦青素峰面積-時間曲線(n=5)Fig.5 The content-time curve of total astaxanthin in excrement after gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    表3 糞便中蝦青素組成變化(n=5)Table3 The changes of astaxanthins in excrement (n=5)

    3.3 蝦青素酯在小鼠血清和肝臟中的代謝動力學研究

    圖6 灌胃蝦青素酯后血清和肝臟中蝦青素的質量濃度變化(n=5)Fig.6 The change of astaxanthin mass concentration in plasma and liver after oral gavage of esterified astaxanthins (n=5)

    試驗小鼠在灌胃蝦青素酯后,在血清和肝臟中僅檢測到游離蝦青素,進一步說明蝦青素酯進入小鼠體內后是以游離態(tài)蝦青素的形式被生物體利用,該結論符合Coral 等[6]的研究報道。模型小鼠血清和肝臟中蝦青素質量濃度隨時間變化曲線如圖6所示,灌胃后,小鼠血清和肝臟中的蝦青素質量濃度明顯上升,且變化趨勢近似,均在12 h 時蝦青素質量濃度達到最高峰值(Cmax),分別為0.215 μg/mL 和0.727 μg/mL;在隨后的12~72 h,蝦青素在血清和肝臟中的質量濃度逐漸下降。通過對比蝦青素在血清和肝臟中的最大積累濃度發(fā)現(xiàn),蝦青素在肝臟中的積累濃度顯著高于在血液中的積累濃度,兩者最大吸收濃度相差約3 倍。試驗結果表明,蝦青素酯在模型小鼠體內能以游離蝦青素的形式發(fā)揮作用。據報道[15-18],類胡蘿卜素生物利用率受到化合物結構形式、 在生物體內的結合方式、溶解度、食品基質等因素的影響。Breithaupt等[19-20]研究表明,游離態(tài)和酯化態(tài)的葉黃素、辣椒紅素和β-玉米黃質在模型動物小腸吸收方面沒有顯著差異。而有關蝦青素酯和游離蝦青素在生物利用率方面的差異性還未見系統(tǒng)報道,有待進一步研究。

    4 結論

    本文通過體內動物實驗,研究了蝦青素酯在小鼠體內的消化吸收過程。結果表明:蝦青素酯在模型動物小腸內先被水解轉化成游離蝦青素,然后以游離態(tài)的形式被消化道壁細胞吸收;蝦青素的吸收部位主要在小腸,在胃中無吸收,在大腸(結腸)中被少量吸收,試驗發(fā)現(xiàn)不同腸段對蝦青素的吸收能力從高到低依次為:空腸>回腸>十二指腸>結腸;灌胃蝦青素酯后,蝦青素在模型小鼠血液和肝臟中達到最大積累濃度的時間均為12 h,且肝臟中的最大濃度約為血清中的3 倍。本研究闡述了蝦青素酯在體內的消化吸收情況,為下一步研究不同分子形式蝦青素化合物在生物體內生物利用率的差異性奠定了基礎,并為蝦青素酯作為功能因子代替游離蝦青素在食品、 藥品行業(yè)中應用提供了科學依據。

    猜你喜歡
    游離態(tài)青素灌胃
    金屬及其化合物知識答疑
    中學化學(2024年5期)2024-07-08 09:24:57
    游離植物甾醇研發(fā)創(chuàng)新管理應用
    6000倍抗氧化能力,“完爆”維C!昶科將天然蝦青素研發(fā)到極致
    當代水產(2021年6期)2021-08-13 08:17:10
    蝦青素在設施草莓上的應用效果
    落葉果樹(2021年6期)2021-02-12 01:29:04
    農村初中數(shù)學建構式生態(tài)課堂中“游離態(tài)”學生成因及對策
    小鼠、大鼠灌胃注意事項
    來曲唑灌胃后EM大鼠病灶體積及COX-2 mRNA、survivin蛋白表達變化
    實驗小鼠的灌胃給藥技巧
    大鼠口服灌胃腰痛寧粉的藥物代謝動力學
    天然蝦青素在鹵蟲體內的代謝積累研究
    食品科學(2013年17期)2013-03-11 18:27:10
    一区二区三区精品91| 久久久久国产网址| 内地一区二区视频在线| 99久久人妻综合| 久久这里有精品视频免费| 天天一区二区日本电影三级| 久久久欧美国产精品| kizo精华| 日韩国内少妇激情av| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲av中文av极速乱| 久久久国产一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 午夜福利在线在线| 久久久亚洲精品成人影院| 国产免费福利视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美日韩综合久久久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| 2022亚洲国产成人精品| 国产精品成人在线| 日韩伦理黄色片| 99久久中文字幕三级久久日本| 九色成人免费人妻av| 久久久久久久午夜电影| 久久综合国产亚洲精品| 嫩草影院入口| 国产人妻一区二区三区在| 久久久a久久爽久久v久久| 国产精品一区二区在线观看99| av国产免费在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 国产 精品1| 亚洲在线观看片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 视频区图区小说| 69人妻影院| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久午夜福利片| 中文字幕亚洲精品专区| 五月开心婷婷网| 精华霜和精华液先用哪个| 亚洲av一区综合| 青春草国产在线视频| 赤兔流量卡办理| 两个人的视频大全免费| a级毛片免费高清观看在线播放| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产黄片美女视频| 亚洲av成人精品一二三区| 国产av国产精品国产| 嘟嘟电影网在线观看| 伦精品一区二区三区| 久久99精品国语久久久| 嫩草影院新地址| 国产亚洲一区二区精品| 免费看光身美女| 亚洲欧美精品专区久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产精品伦人一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 99久久中文字幕三级久久日本| 一区二区三区乱码不卡18| av线在线观看网站| 精品熟女少妇av免费看| 亚洲av免费在线观看| 日本一二三区视频观看| av专区在线播放| 成人毛片a级毛片在线播放| 日韩大片免费观看网站| 在线免费十八禁| 国产色婷婷99| 国产黄色免费在线视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 中国三级夫妇交换| 国产av国产精品国产| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 99热这里只有是精品50| 五月天丁香电影| 久久久久久久大尺度免费视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 婷婷色av中文字幕| 国产在线男女| 精品熟女少妇av免费看| 婷婷色综合大香蕉| 777米奇影视久久| 综合色av麻豆| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一级毛片我不卡| 超碰97精品在线观看| 亚洲精品一二三| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲精品色激情综合| av在线播放精品| 亚洲欧美一区二区三区国产| 嘟嘟电影网在线观看| 赤兔流量卡办理| 国产有黄有色有爽视频| 边亲边吃奶的免费视频| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美zozozo另类| 久久综合国产亚洲精品| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品乱久久久久久| 日韩av免费高清视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一区二区av电影网| 在线观看三级黄色| 一级片'在线观看视频| 欧美zozozo另类| 熟女人妻精品中文字幕| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 九九爱精品视频在线观看| 老女人水多毛片| 特级一级黄色大片| 男女边吃奶边做爰视频| 国产一区二区在线观看日韩| 亚洲av成人精品一二三区| 777米奇影视久久| 青青草视频在线视频观看| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品夜色国产| 久久久久久久久久久丰满| 人妻一区二区av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利高清视频| 我的女老师完整版在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 一区二区三区乱码不卡18| 熟妇人妻不卡中文字幕| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲国产日韩一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 日韩精品有码人妻一区| 国产成人福利小说| 一二三四中文在线观看免费高清| 丝袜脚勾引网站| 99热这里只有精品一区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 久久综合国产亚洲精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 女人被狂操c到高潮| 搞女人的毛片| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产成人福利小说| 麻豆成人午夜福利视频| 丝袜喷水一区| 大陆偷拍与自拍| 国产黄色免费在线视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 大片免费播放器 马上看| av女优亚洲男人天堂| 欧美高清性xxxxhd video| 国产色婷婷99| 国产老妇女一区| 国产真实伦视频高清在线观看| 黑人高潮一二区| 国产免费视频播放在线视频| 超碰97精品在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 国产91av在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 丝袜喷水一区| 久久精品国产自在天天线| 男人和女人高潮做爰伦理| 熟女av电影| 成人国产麻豆网| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 精华霜和精华液先用哪个| 国产亚洲精品久久久com| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久成人免费电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 高清视频免费观看一区二区| 国产男人的电影天堂91| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 身体一侧抽搐| 在线观看免费高清a一片| 国产成人a区在线观看| av播播在线观看一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲国产精品999| 久久久成人免费电影| 国产 精品1| 日韩国内少妇激情av| 97超视频在线观看视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品国产露脸久久av麻豆| 91久久精品国产一区二区三区| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| av在线天堂中文字幕| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日本一二三区视频观看| 五月开心婷婷网| 色哟哟·www| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲欧美精品自产自拍| 免费观看性生交大片5| 丝袜喷水一区| 国产一区二区在线观看日韩| 青春草国产在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 91久久精品国产一区二区成人| 美女被艹到高潮喷水动态| 最新中文字幕久久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲欧美日韩东京热| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品蜜桃在线观看| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 一个人看视频在线观看www免费| 国产成年人精品一区二区| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美三级亚洲精品| 色播亚洲综合网| 赤兔流量卡办理| 久久久久久久久大av| 午夜激情福利司机影院| 色网站视频免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 免费黄频网站在线观看国产| 少妇被粗大猛烈的视频| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 大片电影免费在线观看免费| 在线观看人妻少妇| 亚洲精品成人久久久久久| 在线免费十八禁| 五月开心婷婷网| 亚洲精品国产色婷婷电影| 直男gayav资源| 只有这里有精品99| 男插女下体视频免费在线播放| 国产毛片在线视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 老女人水多毛片| 精华霜和精华液先用哪个| 国产精品99久久99久久久不卡 | 男人爽女人下面视频在线观看| 少妇高潮的动态图| 青青草视频在线视频观看| 精品视频人人做人人爽| 亚洲av男天堂| 亚洲图色成人| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲av日韩在线播放| av国产精品久久久久影院| 秋霞伦理黄片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久热久热在线精品观看| 91久久精品电影网| 国产精品熟女久久久久浪| 网址你懂的国产日韩在线| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产日韩欧美亚洲二区| 视频区图区小说| 秋霞在线观看毛片| av在线蜜桃| 69av精品久久久久久| 日韩电影二区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产中年淑女户外野战色| av天堂中文字幕网| 综合色丁香网| 国产午夜精品一二区理论片| 高清日韩中文字幕在线| 美女视频免费永久观看网站| av在线蜜桃| 国产精品女同一区二区软件| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品久久久久久精品电影| 少妇熟女欧美另类| 寂寞人妻少妇视频99o| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产色婷婷99| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av免费高清在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品av视频在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 免费人成在线观看视频色| 男女下面进入的视频免费午夜| 简卡轻食公司| 日本-黄色视频高清免费观看| av在线播放精品| 久热这里只有精品99| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 在线免费观看不下载黄p国产| .国产精品久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 高清欧美精品videossex| 欧美激情国产日韩精品一区| 黑人高潮一二区| 日韩一区二区三区影片| 日韩欧美 国产精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲国产精品999| 久久久精品94久久精品| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲av男天堂| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 又大又黄又爽视频免费| 晚上一个人看的免费电影| 日本与韩国留学比较| 亚洲成人久久爱视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产黄片美女视频| 色播亚洲综合网| 成人高潮视频无遮挡免费网站| av在线天堂中文字幕| 少妇的逼水好多| 久久久国产一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 97超视频在线观看视频| 成人美女网站在线观看视频| 国产成人精品婷婷| 可以在线观看毛片的网站| 日韩三级伦理在线观看| 夜夜爽夜夜爽视频| 五月玫瑰六月丁香| 精品久久久噜噜| 色吧在线观看| 丝袜喷水一区| 亚洲av福利一区| 亚洲av成人精品一区久久| 少妇人妻久久综合中文| 在线观看人妻少妇| 777米奇影视久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 七月丁香在线播放| 观看免费一级毛片| 啦啦啦在线观看免费高清www| 国产高清三级在线| 高清av免费在线| 在线观看一区二区三区激情| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产精品女同一区二区软件| 国产成人freesex在线| 深爱激情五月婷婷| 亚洲欧美日韩东京热| 国产黄片视频在线免费观看| 亚洲最大成人中文| 欧美成人a在线观看| 国产精品一区二区在线观看99| 性插视频无遮挡在线免费观看| 五月开心婷婷网| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产淫片久久久久久久久| 日本-黄色视频高清免费观看| 婷婷色综合www| 熟女电影av网| 亚洲最大成人手机在线| 国产永久视频网站| 久久久久性生活片| 久久国产乱子免费精品| 成人亚洲精品av一区二区| 在线观看一区二区三区| 极品少妇高潮喷水抽搐| 777米奇影视久久| 男女无遮挡免费网站观看| 有码 亚洲区| 秋霞伦理黄片| 青春草亚洲视频在线观看| 尾随美女入室| 国精品久久久久久国模美| 女人久久www免费人成看片| 国产精品久久久久久av不卡| 人体艺术视频欧美日本| 99久国产av精品国产电影| 我的老师免费观看完整版| 久久久久网色| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 嘟嘟电影网在线观看| 看非洲黑人一级黄片| 特大巨黑吊av在线直播| 久久99热这里只有精品18| 伊人久久国产一区二区| 亚洲av福利一区| 美女被艹到高潮喷水动态| 男女国产视频网站| 高清视频免费观看一区二区| 国产免费视频播放在线视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 老司机影院成人| 国产高潮美女av| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 国产成人免费观看mmmm| 联通29元200g的流量卡| 国产亚洲最大av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 搡女人真爽免费视频火全软件| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美97在线视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 麻豆成人av视频| 国产成人免费无遮挡视频| 色网站视频免费| 五月天丁香电影| 亚洲av中文av极速乱| 人妻系列 视频| 亚洲天堂av无毛| 99热这里只有精品一区| 国产成年人精品一区二区| 久久这里有精品视频免费| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品99久久久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产av码专区亚洲av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产精品国产三级专区第一集| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 观看美女的网站| 国产高清三级在线| 99热网站在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 日韩欧美精品v在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 舔av片在线| 国产高清国产精品国产三级 | 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 五月开心婷婷网| 搡老乐熟女国产| 黄色欧美视频在线观看| 一级毛片 在线播放| 欧美日韩亚洲高清精品| 男的添女的下面高潮视频| 偷拍熟女少妇极品色| 国产色婷婷99| 色吧在线观看| 国产精品一二三区在线看| 亚洲电影在线观看av| 日本av手机在线免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 日本黄大片高清| 亚洲av.av天堂| 五月天丁香电影| 99视频精品全部免费 在线| 丝袜美腿在线中文| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品三级大全| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一本色道久久久久久精品综合| 水蜜桃什么品种好| 青青草视频在线视频观看| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 黄片wwwwww| 免费在线观看成人毛片| 国产永久视频网站| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品久久久久久久电影| 欧美成人一区二区免费高清观看| 丝瓜视频免费看黄片| 成年版毛片免费区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 99re6热这里在线精品视频| av在线天堂中文字幕| 人人妻人人看人人澡| 一级a做视频免费观看| 国产色婷婷99| 一级片'在线观看视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区二区av电影网| 国产大屁股一区二区在线视频| 成人国产av品久久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 色哟哟·www| 午夜视频国产福利| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 日韩av免费高清视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 欧美区成人在线视频| 精品久久久久久久末码| 夫妻性生交免费视频一级片| videossex国产| 日韩国内少妇激情av| 欧美zozozo另类| 我的老师免费观看完整版| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲精品乱久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 特大巨黑吊av在线直播| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 内射极品少妇av片p| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲自拍偷在线| 国产 一区 欧美 日韩| 激情 狠狠 欧美| 久久久久久久久久久免费av| 亚洲人与动物交配视频| 日韩精品有码人妻一区| 国产在线男女| 国产成人a∨麻豆精品| 在线观看av片永久免费下载| 99热这里只有精品一区| 久久久精品94久久精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产中年淑女户外野战色| 亚洲伊人久久精品综合| 欧美高清成人免费视频www| 国模一区二区三区四区视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 18禁在线播放成人免费| 成年女人看的毛片在线观看| 嘟嘟电影网在线观看| 午夜激情久久久久久久| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产 精品1| 搡女人真爽免费视频火全软件| 赤兔流量卡办理| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 神马国产精品三级电影在线观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| av.在线天堂| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 亚洲内射少妇av| 大香蕉久久网| 午夜激情福利司机影院| 日日撸夜夜添| 内射极品少妇av片p| 成年人午夜在线观看视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产黄色免费在线视频| 观看免费一级毛片| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品aⅴ在线观看| 中文字幕制服av| 国产成人福利小说| 国产男女超爽视频在线观看| 少妇熟女欧美另类| 爱豆传媒免费全集在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一区二区av电影网| 中国美白少妇内射xxxbb| 亚洲最大成人手机在线| 99热国产这里只有精品6| 赤兔流量卡办理| 最近手机中文字幕大全| 美女主播在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| 国产在视频线精品| 五月伊人婷婷丁香| 波多野结衣巨乳人妻| 一本久久精品| 亚洲精品成人久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲天堂av无毛| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲国产最新在线播放| 欧美日韩视频精品一区| a级一级毛片免费在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 免费观看a级毛片全部| 真实男女啪啪啪动态图| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 永久免费av网站大全| 九九爱精品视频在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产在线一区二区三区精| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 亚洲天堂国产精品一区在线| av国产精品久久久久影院| 男人舔奶头视频| 精品久久久噜噜| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 日韩欧美精品v在线| a级一级毛片免费在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 26uuu在线亚洲综合色|