ε-聚賴氨酸對大腸桿菌O157：H7和金黃色葡萄球菌的抗菌穩(wěn)定性

郭文燕 童雅琪 余雅琦 周勝男 常 超* 伍金娥，2

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢430023 2 武漢輕工大學(xué) 大宗糧油精深加工教育部重點實驗室 農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點實驗室武漢430023）

大腸桿菌O157：H7 （Escherichia coli O157：H7）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為典型的革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌的代表菌，是引起人和動物感染的常見病原菌，也是引發(fā)食品中毒的重要病原菌[1-2]。特別是大腸桿菌O157：H7是國內(nèi)外疾病控制中心（CDC）重點關(guān)注的食源性致病菌之一，無論是發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家均有大腸桿菌0157：H7 導(dǎo)致食物中毒事件發(fā)生，已成為威脅全球人群健康的重要公共衛(wèi)生問題[3]。控制這類食源性病原菌的傳播與爆發(fā)一直是食品加工企業(yè)重點關(guān)注的問題。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，簡稱ε-PL）是一種由賴氨酸單體分子在α-羧基和ε-氨基形成酰胺鍵而連接成的均聚氨基酸。這類直鏈多聚體約由20～30 個賴氨酸殘基組成，由一類白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）代謝產(chǎn)生[4-5]。由于ε-PL 在體內(nèi)可以分解為人體必需的L-賴氨酸，因此ε-PL 也被認(rèn)為是一種高安全性的天然食品防腐劑，具有抗菌譜廣，水溶性好的特點，具有潛在的商業(yè)利用價值[6-8]，已于2003年10月被FDA 批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑。目前我國已批準(zhǔn)ε-PL 作為食品防腐劑應(yīng)用于焙烤制品、熟肉制品以及果蔬汁[9]。對其抗菌機(jī)理的研究表明，它能夠通過靜電作用吸附到微生物表面，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，進(jìn)而影響微生物生長繁殖，它能夠抑制包括革蘭氏陽性菌、陰性菌、霉菌和酵母菌在內(nèi)的多種微生物的生長繁殖，且抑菌能力強(qiáng)[10]。從應(yīng)用角度來講，ε-PL 能否與其它物質(zhì)配合使用，提高ε-PL 的抗菌活性是一個值得探討的科學(xué)問題，對此也進(jìn)行了大量研究[11-13]。加工溫度、pH 值、金屬離子是食品加工涉及的三大要素，明確ε-PL 在不同條件下對病原菌抗菌活性的穩(wěn)定性，是提高ε-PL 抗菌活性，指導(dǎo)ε-PL 應(yīng)用提供必要的理論基礎(chǔ)。

本研究采用微量液體稀釋法，首先找出ε-PL對兩種代表性的食源性病原菌的最小抑菌濃度即MIC 值，再研究不同加工溫度、pH 條件下ε-PL 和ε-PL 與金屬離子共同作用對各種菌的抑菌效果，判斷其穩(wěn)定性，旨在為合理應(yīng)用ε-PL 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料與試劑 ε-PL，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；純度為99%，硫酸鋅、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鉀、硫酸錳均為化學(xué)純級試劑。金黃色葡萄球菌，武漢大學(xué)微生物菌種保藏中心；大腸桿菌O157：H7，武漢輕工大學(xué)生命工程學(xué)院微生物教研室。

1.1.2 儀器與設(shè)備 SW-CJ-2FD 雙人超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DHG-9070A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、GHP-9050 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UPK-I-10T 超純水儀，成都超純科技有限公司；BCD-219K 冰箱，青島海爾股份有限公司；BS2240 電子天平，德國賽多利斯；YXQ-LS-70A 自動高壓滅菌鍋，上海博迅實業(yè)有限公司；DK-S11 恒溫水浴鍋，鞏義市英峪予華儀器廠；PHS-3C 精密pH 計，上海雷磁儀器廠；Enspire 酶標(biāo)儀，珀金埃爾默儀器有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，按常規(guī)制備培養(yǎng)基的方法制備，121 ℃滅菌15 min，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 ε-PL 最小抑菌濃度（MIC）的測定 精確稱取適量的ε-PL 干粉，溶于無菌水中，配制樣液比為1∶6 的ε-PL 溶液。在無菌條件下采用微量稀釋法測定ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC），取2 個無菌的96 孔板，將ε-PL 溶液用無菌水在96 孔板中進(jìn)行二倍稀釋，在兩個96 孔板中分別加入不同的菌懸液（1×106CFU/mL），混均后置于培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，再將96 孔板置于波長600 nm 的光密度測定儀，測其光密度值（OD 值）。MIC 值為完全抑制細(xì)菌生長所需的抑菌物質(zhì)最低濃度，反應(yīng)抑菌劑抑菌能力的大小。用肉眼觀察溶液的渾濁情況與OD 值相結(jié)合的方法，判定MIC 值的大小。

1.2.2 不同pH 值對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 調(diào)節(jié)濃度為4MIC 的ε-PL 溶液的pH 值為4，5，6，7，8，9，作用一段時間后，取2 個無菌的96 微孔板置于超凈臺上，將上述不同pH 值的ε-PL 溶液、無菌水和兩種菌懸液（1×106CFU/mL）分別加入對應(yīng)的96 微孔板中，使菌懸液終濃度相同以及ε-PL 的終濃度分別為1/4MIC，1/2MIC，MIC，2MIC，混均后放入恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h。測OD 值，比較不同pH 值條件下提取液的抑菌穩(wěn)定性，確定其pH 值活性范圍。

1.2.3 不同溫度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 將濃度為4MIC 的ε-PL 溶液分別在4，20，40，60，80，100，121 ℃條件下處理30 min，方法同1.2.2，測OD 值，觀察溶液的渾濁情況，考察ε-PL 的熱穩(wěn)定性。

1.2.4 不同金屬離子及其濃度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響 分別配制0.1 mol/L 的KCl，NaCl，ZnSO4，MnSO4，CaCl2，MgCl2溶液，將金屬離子用無菌水在96 孔板中進(jìn)行二倍稀釋，然后將濃度為2MIC 的ε-PL 溶液、 無菌水和兩種菌懸液（1×106CFU/mL）分別加入對應(yīng)的96 微孔板中，使金屬離子終濃度分別為0，0.15625，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 mmol/L，ε-PL 的終濃度分別為1/5MIC，2/5MIC，4/5MIC 以及菌懸液終濃度相同?；炀蠓湃牒銣嘏囵B(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察微孔中溶液的渾濁度，測定OD 值。結(jié)果用細(xì)菌生長的抑制率來表示。

抑制率（%）= [（對照組OD600-Men+聯(lián)合處理組OD600）/對照組OD600]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 ε-PL 對各菌的最小抑菌濃度（MIC）

不同質(zhì)量濃度的ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 抑制趨勢見圖1。ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7的抑制隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度超過2.6 mg/mL 時，OD 值趨于平緩，并且培養(yǎng)液澄清透明，由此判斷ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 最小抑菌濃度均為2.6 mg/mL，該 溶 液 環(huán) 境 的pH 值 為6.87，這 與Geornaras 等[14]的研究結(jié)果相符合，說明ε-PL 應(yīng)為一廣譜抗菌素，對革蘭氏陽性與革蘭氏陰性菌均有較好的抑菌效果。

圖1 不同質(zhì)量濃度ε-聚賴氨酸對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 生長的影響Fig.1 Effect of different mass concentrations of ε-PL against S.aureus and E.coli O157：H7

2.2 不同溫度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）影響

由圖2可知，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加，對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強(qiáng)。在本試驗設(shè)置溫度下處理30 min 對ε-PL的抑菌效果影響并不顯著，經(jīng)過各個溫度處理的ε-PL 在最小抑菌濃度（MIC）與細(xì)菌共同培養(yǎng)的溶液仍然呈澄清透明狀態(tài)，說明熱處理不影響其抗菌活性，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7具有良好的抑菌效果，并且抑菌效果穩(wěn)定。倪清艷等[15]用牛津杯抑菌試驗測定的最高溫度為121 ℃下處理20 min，呈現(xiàn)出較穩(wěn)定的抗菌活性，與本試驗中采用的微量稀釋法測定121 ℃下處理30 min的結(jié)果基本一致。因此，本結(jié)果進(jìn)一步證實了不同溫度處理后的ε-PL，其抗菌活性并不受影響，從分子結(jié)構(gòu)上可能并未發(fā)生顯著變化，表明這一抗菌素適合用于冷、熱食品的保藏，還能夠承受一般食品加工過程中的熱處理，可以隨原料一同做滅菌處理，有效阻止二次污染。

2.3 不同pH 值對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響

由圖3可知，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加，對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌效果增強(qiáng)。隨著pH 值的升高，ε-PL 對大腸桿菌O157：H7 和金黃色葡萄球菌的抑菌能力呈相似的變化趨勢，均呈下降趨勢，經(jīng)過pH 值為4～5 處理的ε-PL，其終濃度為1/2MIC 時與細(xì)菌共同培養(yǎng)的溶液呈澄清透明，說明當(dāng)pH 值為4～5 時，其最小抑菌濃度為1/2MIC，即在酸性條件下，ε-PL 具有非常好的穩(wěn)定性，抑菌效果較堿性條件下顯著。該試驗結(jié)果與前人報道采用ε-PL 與醋酸復(fù)合作用對耐熱性較強(qiáng)的枯草芽孢桿菌等芽孢菌的抑制效果優(yōu)于單獨使用時的抑菌效果的結(jié)論相似。在堿性條件下處理的ε-PL，其終濃度為2MIC 時與細(xì)菌共同培養(yǎng)的溶液呈澄清透明，說明當(dāng)pH 值為7～9 時其最小抑菌濃度為2MIC，可能是在堿性條件下，使得ε-PL 抗菌活性降低；這點對于食品保鮮尤為重要，提示ε-PL 可以用于酸性食品的貯藏保鮮，而在用于堿性食品保藏時，需提高ε-PL 質(zhì)量濃度方可起到殺菌效果。

圖2 不同溫度對ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響Fig.2 Effect of thermal treatments on antibacterial activity of ε-PL

圖3 不同pH 值對ε-聚賴氨酸抑菌活性的影響Fig.3 Effect of pH values on antibacterial activity of ε-PL

2.4 不同金屬離子及濃度對ε-PL 的最小抑菌濃度（MIC）的影響

在1/5MIC，2/5MIC，4/5MIC 的ε-PL 溶液加入金屬離子，對大腸桿菌O157：H7 及金黃色葡萄球菌作用結(jié)果分別如圖4與圖5所示。

圖4 不同金屬離子對ε-聚賴氨酸抑制大腸桿菌O157：H7 效果的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of ε-PL against E.coli O157：H7

圖4顯示，Zn2+與Mn2+對大腸桿菌O157：H7造成的抑制效應(yīng)最強(qiáng)，呈劑量反應(yīng)關(guān)系，Zn2+為0.15625 mmol/L，即可表現(xiàn)出增效作用，Mn2+與ε-PL 溶液濃度為2/5MIC，在5 mmol/L 出現(xiàn)十分顯著的增效作用。不同濃度的Na+、K+與ε-PL 作用僅表現(xiàn)出十分有限的抑制效應(yīng)，而Mg2+呈現(xiàn)出抵消殺菌效應(yīng)。天然防腐劑ε-PL 對微生物的抑制機(jī)制主要表現(xiàn)為破壞膜結(jié)構(gòu)以及完整的能量代謝系統(tǒng)，從而抑制細(xì)胞膜的呼吸作用，導(dǎo)致胞內(nèi)溶酶體膜破裂而誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生自溶作用。在革蘭氏陰性菌體細(xì)胞壁上，脂多糖帶負(fù)電荷，能吸附Mg2+以提高這些離子在細(xì)胞表面濃度的作用，起到穩(wěn)定細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的作用[16]。因此，從本試驗結(jié)果來看，Mg2+呈現(xiàn)出抵消ε-PL 殺菌效應(yīng)，對微生物具有保護(hù)作用。

圖5 不同金屬離子對ε-聚賴氨酸抑制金黃色葡萄球菌效果的影響Fig.5 Effect of metal ions on antibacterial activity of ε-PL against S.aureus

金屬離子和ε-PL 溶液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果如圖5所示，Zn2+或Mn2+加至ε-PL，隨著ε-PL 質(zhì)量濃度的增加對金黃色葡萄球菌造成的抑制效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，隨后趨于穩(wěn)定；ε-PL 在3 種質(zhì)量濃度下與不同濃度的Na+，K+，Ca2+作用，僅表現(xiàn)出較弱的抑制效應(yīng)。Mg2+與3 種不同質(zhì)量濃度的ε-PL 共同作用于金黃色葡萄球菌時，反而表現(xiàn)出增殖效益，促進(jìn)了細(xì)菌的生長，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系；因此，Mg2+可以消除ε-PL 的抑菌效應(yīng)，可能由于革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁，與磷壁酸 （teichoicacid）相似，也帶負(fù)電荷，通過靜電吸附作用濃縮細(xì)胞周圍的Mg2+，以提高細(xì)胞膜上一些合成酶的活性[16]。盡管本試驗中其它金屬離子均帶正電荷，但卻沒有發(fā)生與Mg2+的作用效應(yīng)，這種現(xiàn)象可能與酶對金屬離子的選擇性有關(guān)。

3 結(jié)論

在食品加工工業(yè)中，溫度、pH 值、金屬離子是影響食品品質(zhì)的三大要素，研究其對ε-PL 對以金黃色葡萄球菌為代表的革蘭氏陽性和以大腸桿菌O157：H7 為代表的革蘭氏陰性菌的殺菌效果的影響，能為合理應(yīng)用ε-PL 提供理論依據(jù)。

本研究結(jié)果表明，ε-PL 對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好的抑菌效果；在酸性條件下ε-PL 較穩(wěn)定，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌O157：H7 的抑菌效果較好，降低pH 值能使最小抑菌濃度有所減小，在堿性條件下活性降低，結(jié)果提示ε-PL 能良好用于酸性食品的貯藏保鮮，在堿性環(huán)境下，需提高ε-PL 的使用劑量；在4～121 ℃下，ε-PL 的熱穩(wěn)定性較好；Mn2+、Zn2+與ε-PL 具有較高的協(xié)同作用，應(yīng)避免與Mg2+混合使用，這一結(jié)果為ε-PL 用于抗菌膜等的形式提供了理論依據(jù)。