脂肪酸位置分布對(duì)嬰幼兒奶粉油脂乳液體外模擬消化的影響

袁婷蘭 伍文彬 朱雪梅 熊 華

（南昌大學(xué)食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌330047）

嬰兒主要以母乳或嬰幼兒配方奶粉為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，其中脂肪是主要營(yíng)養(yǎng)素之一，提供其生長(zhǎng)發(fā)育所需大約50%～60%的熱量[1]。母乳脂肪是以O(shè)PO為代表的TAG 結(jié)構(gòu)，目前市場(chǎng)上多數(shù)嬰兒配方奶粉添加植物調(diào)和油，使其脂肪酸組成接近母乳，然而，二者在脂肪結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。植物油飽和脂肪酸如棕櫚酸多分布于sn-1，3 位，不飽和脂肪酸大都分布在sn-2 位[2]。目前以O(shè)PO 型TAG（Triacylglycerol）分子結(jié)構(gòu)為主的母乳脂肪替代脂（Human milk fat substitute，HMFS）是較傳統(tǒng)嬰兒配方奶粉的升級(jí)，也是目前乳品和油脂領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道采用不同原料（如豬油、牛乳脂肪）以及不同方式合成HMFS[3-4]，對(duì)嬰幼兒奶粉的研發(fā)，嬰幼兒的健康成長(zhǎng)有重大意義，然而其營(yíng)養(yǎng)消化性有待評(píng)價(jià)。

不同結(jié)構(gòu)TAG 同嬰幼兒的消化、吸收以及代謝有密切關(guān)系。甘油三酯的脂肪酸種類(lèi)和位置分布決定脂肪酸的吸收形式，胰脂肪酶的專(zhuān)一性，決定了脂肪酸的吸收形式2-MAG（Monoacylglycerol）或游離脂肪酸。因此母乳和奶粉TAG 脂肪酸位置的差異，對(duì)嬰兒脂肪的代謝吸收至關(guān)重要。已有大量體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明在嬰幼兒配方奶粉生產(chǎn)中采用OPO 結(jié)構(gòu)脂肪，可促進(jìn)大鼠腸道對(duì)脂肪和鈣的吸收[5-6]。然而其在胃腸道消化的具體機(jī)理還不清楚。近年來(lái)，體外實(shí)驗(yàn)由于其操作簡(jiǎn)單，成本低等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用。目前已有大量的研究者采用體外消化模型模擬人體胃、 腸道研究乳液脂肪的消化，且逐步發(fā)展[7-8]。Ménard 等[9]用一個(gè)新的模擬嬰兒胃、 腸道的電腦系統(tǒng)控制的動(dòng)力消化模型評(píng)價(jià)嬰兒奶粉的消化性能。同課題組的Oliveira 等[10]用同樣的體外動(dòng)力消化模型研究了巴氏殺菌的母乳對(duì)足月新生兒消化過(guò)程中蛋白質(zhì)和脂肪水解的影響。目前還有大量文獻(xiàn)采用體外消化模型研究乳液的消化情況，多數(shù)考察了宏觀上消化程度和速率的差異。為更深層地研究奶粉脂肪消化的影響機(jī)制，本文對(duì)普通型和OPO 型兩種嬰幼兒奶粉油脂制備的乳液進(jìn)行體外模擬消化，比較其消化過(guò)程中的界面性質(zhì)，消化產(chǎn)物中游離脂肪酸組成、甘油單酯組成以及微觀結(jié)構(gòu)的變化。以期為補(bǔ)充和完善脂肪消化機(jī)理，為有益于嬰兒消化吸收的奶粉的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

奶粉油脂，江西人之初有限公司饋贈(zèng)。

脂肪酸甲酯混標(biāo)GLC-463，NU-CHEK-PREP公司；BF3-甲醇溶液、胃蛋白酶、胃脂肪酶、豬胰酶，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；牛膽鹽，西亞試劑；正己烷（色譜純），美國(guó)天地試劑公司。

Nano-ZS 90 激光納米粒度儀，英國(guó)馬爾文公司；Agilent GC 7890（FID）氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；GF254 薄層層析板，青島海洋化工廠分廠；RH-A Basic 磁力攪拌器、Ultra Turrax T25 高速分散機(jī)，德國(guó)IKA 公司；Model 101 高壓微射流，美國(guó)Newton 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪酸組成的測(cè)定 總脂肪酸組成測(cè)定：稱(chēng)取約2 mg 油樣，加入1.5 mL 0.5 mol/L 氫氧化鈉甲醇溶液，置于80 ℃水浴上回流5 min，冷卻至室溫，再加入2 mL 三氟化硼甲醇溶液，繼續(xù)回流15 min，冷卻至室溫，用飽和氯化鈉溶液清洗，加入2 mL 正己烷，振搖后，離心取上層清液，過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱子脫水干燥后，N2濃縮，用1 mL 正己烷溶解，裝入進(jìn)樣瓶，采用氣相色譜儀配有氫火焰離子檢測(cè)器進(jìn)行分析。將所得圖譜與脂肪酸的混標(biāo)比較對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定脂肪酸的種類(lèi)，面積歸一法定量確定各種脂肪酸的相對(duì)摩爾百分比含量。

sn-2 脂肪酸組成測(cè)定：根據(jù)胰脂酶水解TAG后得到游離脂肪酸和sn-2 MAG，采用薄層色譜分離其水解產(chǎn)物，刮下sn-2 MAG 條帶，提取甘油單酯，將其甲酯化后進(jìn)行氣相色譜的分析。

1.2.2 乳液的制備 根據(jù)Giang 等[11]研究報(bào)道中所采用的乳液制備方法，稍作改動(dòng)。

制備兩種蛋白膜乳液，先將一定量的乳化劑（乳清蛋白∶酪蛋白酸鈉=35∶65）溶于超純水，恒溫水浴中攪拌4 h 以上使充分溶解水化。將完全溶解水化的97%的蛋白溶液與3%奶粉油脂（普通型和OPO 型）混合攪拌5 min，然后經(jīng)高速剪切分散機(jī)乳化3 min，再經(jīng)20 MPa 高壓均質(zhì)處理，制備穩(wěn)定的蛋白O/W 型乳液（1.0%乳化劑，3%油）。得到普通型和OPO 型兩種結(jié)構(gòu)油脂的乳液。

1.2.3 體外消化模型 本研究所用體外模擬消化水解模型，是以嬰兒體內(nèi)胃腸環(huán)境特點(diǎn)為基礎(chǔ)，對(duì)前人研究中所用的嬰兒體內(nèi)脂類(lèi)物質(zhì)體外消化模型實(shí)驗(yàn)條件略做改動(dòng)。

胃液的配制：模擬胃液 （SGF） 的配制，以Céline 等[12]報(bào)道的嬰兒胃部消化特征，并參照Lueamsaisuk 等[13]的方法，進(jìn)行一些改進(jìn)。稱(chēng)取0.2 g NaCl，加1.3 mL 1 mol/L HCl，溶解于80 mL 去離子水中，用0.1 mol/L HCl 將溶液pH 值調(diào)至4.5，去離子水定容至100 mL。稱(chēng)取2.5 mg 胃脂肪酶和0.25 mg 胃蛋白酶加入2.5 mL 上述溶液，室溫下磁力攪拌10 min 即為SGF。

小腸液的配制：模擬小腸液（SIF）的配制，以Claire 等[14]綜述報(bào)道的嬰兒腸道環(huán)境特征，參照Bosscher 等[15]方法，進(jìn)行一些改進(jìn)。稱(chēng)取8.78 g NaCl，0.37 g KCl，6.60 g CaCl2，用去離子水溶解，用0.2 mol/L NaOH 將溶液pH 值調(diào)至6.5，去離子水定容至1 L。稱(chēng)取5 mg 膽鹽，10 mg 胰酶溶于10 mL 上述溶液，37 ℃下磁力攪拌10 min 即為SIF。

模擬消化：取10 mL 乳液于37 ℃水浴中恒溫10 min；pH 值調(diào)至5.5，加入2.5 mL SGF，37 ℃攪拌，消化0.5 h，再用0.2 mol/L NaOH 將經(jīng)過(guò)模擬胃液消化后的消化液pH 值調(diào)至6.5，加入10 mL模擬腸液，進(jìn)行模擬小腸階段的消化2 h，在此期間，不斷滴加0.1 mol/L NaOH 溶液，使體系pH 值保持在6.5 不變，記錄不同時(shí)間所消耗的NaOH的量。整個(gè)過(guò)程恒定溫度37 ℃。每個(gè)樣品進(jìn)行至少3 次模擬消化試驗(yàn)。

1.2.4 消化過(guò)程游離脂肪酸釋放率計(jì)算 根據(jù)消化過(guò)程中NaOH 溶液的消耗量來(lái)測(cè)定樣品的脂肪酸釋放。計(jì)算公式如下：

式中，C——NaOH 溶液的濃度 （0.1 mol/L）；V——t 時(shí)間消耗的NaOH 溶液的量（mL）；M——油脂的摩爾質(zhì)量（g/mol）；m--加入的乳液中油脂的質(zhì)量（g）。

1.2.5 乳液粒徑和電位的測(cè)定 采用激光納米粒度儀在25 ℃下測(cè)定乳液消化前和消化過(guò)程中的粒徑和zeta 電位。

1.2.6 消化產(chǎn)物脂肪酸分析 消化樣加入石油醚振蕩分離得到醚層和水層，醚層脫去溶劑提取脂肪，經(jīng)TLC 薄層色譜分離其水解產(chǎn)物（TAG，DAG，MAG，F(xiàn)FA），刮其對(duì)應(yīng)的條帶，采用GC 對(duì)FFA 和MAG 脂肪酸組成進(jìn)行分析。

1.2.7 消化過(guò)程中乳液微觀結(jié)構(gòu)的變化 取1 mL 樣品用10 μL 熒光染料尼羅紅（0.01%）和固綠（0.01%）染色，充分搖勻；將染色后的樣品滴加到載玻片上后蓋上蓋玻片，采用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用SPSS 16.0 軟件中的獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 油脂脂肪酸組成分析

兩種油脂中的TAG 脂肪酸組成及sn-2 位組成分布如表1所示，這對(duì)嬰兒的營(yíng)養(yǎng)有重大意義，與其在嬰兒體內(nèi)的消化吸收有很大關(guān)系。兩者含量 大 于3%的 脂 肪 酸 為C18：1，C16：0，C18：2，C18：0，C14：0，C12：0。與鄒孝強(qiáng)[3]所報(bào)道的人乳脂含量相比，主要的脂肪酸含量相似，還存在一些差異，奶粉油脂C18：2和C18：3的含量要比人乳脂肪高，且超長(zhǎng)鏈的n3 多不飽和脂肪酸含量很少。兩種油脂sn-2 位脂肪酸組成與人乳脂肪相比，發(fā)現(xiàn)OPO 型油脂除了C18：1略高，其它含量接近。而普通型油脂sn-2 位脂肪酸組成與人乳脂肪差別較大，其飽和脂肪酸（SFA）含量低于人乳，主要是C16：0顯著低于OPO型油脂和人乳，而UFA 在sn-2 含量均高于人乳。由于OPO 型油脂sn-2 位上PUFA-3 含量較低，普通型油脂C18：2n6含量較高，使兩者n6/n3 值超出人乳范圍（1.97-7.18）。

表1 奶粉油脂的脂肪酸組成以及sn-2 脂肪酸組成Table1 Fatty acid distribution and composition of the fat for infant formula

2.2 乳液體外模擬消化過(guò)程中消化曲線的分析

試驗(yàn)分別測(cè)定了不同消化時(shí)間內(nèi) （0～150 min）模擬胃消化30 min（圖1a 和1b）及腸消化120 min （圖1c 和1d）乳液的FFA 釋放率，以比較其在消化過(guò)程中的消化速率和消化程度，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 普通型和OPO 型油脂乳液體外模擬消化過(guò)程中的FFA 釋放率Fig.1 The percentage of FFA released of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion

由圖1可知，整個(gè)消化過(guò)程中，兩種乳液在胃消化期FFA 釋放率隨時(shí)間上升；腸消化階段的消化曲線呈“先快后緩”的上升趨勢(shì)，初期兩種油均快速水解，F(xiàn)FA 釋放率上升較快，消化速率快；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，45 min 后，消化速率明顯降低，曲線逐漸趨于平緩。這說(shuō)明有消化產(chǎn)物積累在油滴表面，產(chǎn)物積累的速率大于脫離的速率，阻礙了脂肪酶與油脂的接觸，從而抑制了水解反應(yīng)。

比較兩種乳液的消化曲線可知，在胃消化階段，OPO 型油脂乳液較普通型油脂乳液消化程度高，這很可能與二者粒徑、脂肪酸組成有關(guān)。初始胃消化階段，OPO 型油脂乳液平均粒徑較小，在油水界面處有更大的接觸面積，容易與脂肪酶結(jié)合，表現(xiàn)出胃消化階段較高程度的水解反應(yīng)。然而，模擬腸消化階段最終普通型油脂乳液消化程度比OPO 型高。從脂肪酸組成來(lái)看，OPO 型油脂的sn-2 位主要是飽和脂肪酸，普通型油脂的不飽和脂肪酸則主要分布在sn-2 位，而水解脂肪的胰脂肪酶是sn-1，3 特異性酶，以此推測(cè)OPO 型油脂乳液消化程度更高，圖中結(jié)果卻相反。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是二者脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度和不飽和度差異帶來(lái)的影響。其一，較OPO 型油脂，普通型多不飽和度高，不飽和度的增加，加速了油的消化，有研究證實(shí)多不飽和脂肪酸有更高的消化性[16]。其二，中鏈脂肪酸比長(zhǎng)鏈脂肪酸水溶解性更好[17]，OPO型油脂長(zhǎng)鏈脂肪酸量較高，從而使其水解程度較低。徐俊杰[18]比較豬油和可可脂在體外模擬消化過(guò)程中的消化程度也得到類(lèi)似結(jié)果，解釋油滴上吸附脂肪酸后表面微環(huán)境的pH 并不完全處于中性狀態(tài)，可能有?；w移的影響。

2.3 乳液體外模擬消化過(guò)程中粒徑的分析

OPO 型油脂乳液和普通型油脂乳液消化過(guò)程中平均粒徑的變化如圖2所示，整個(gè)消化過(guò)程中，兩種乳液平均粒徑都是先增大后降低再增大。胃消化反應(yīng)開(kāi)始，水解酶吸附在油滴表面，替換或水解了部分蛋白，使平均粒徑相對(duì)增加；進(jìn)入腸消化階段后，隨胰酶和膽鹽加入，水解反應(yīng)迅速加快，繼續(xù)替換界面組成，粒徑大幅增加。相對(duì)于普通型油脂，OPO 型油脂水解釋放較多的不飽和脂肪酸，更容易從表面除去，呈下降趨勢(shì)。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，脂肪酸在油滴表面大量吸附，其速率大于脫離速率，抑制酶解反應(yīng)的進(jìn)行，顆粒發(fā)生絮凝和聚集，導(dǎo)致平均粒徑增加。

2.4 乳液體外模擬消化過(guò)程中zeta 電位的分析

兩種乳液初始電位表明二者均穩(wěn)定，消化過(guò)程zeta 電位變化趨勢(shì)大致相同，均呈先升高后略降低的趨勢(shì)。對(duì)比圖3發(fā)現(xiàn)，OPO 型油脂乳液電位升高得更快，結(jié)合其平均粒徑變化結(jié)果，可能先是水解產(chǎn)物、膽鹽的混合膠粒附著在油滴表面，后是吸附了小分子的非離子型表面活性物質(zhì)如蛋白酶水解蛋白生成的氨基酸。電位的變化說(shuō)明油滴表面組成發(fā)生了改變，消化過(guò)程中油滴表面重復(fù)著膽鹽、水解產(chǎn)物等的附著和脂肪酶的替換。

圖2 普通型和OPO 型油脂乳液體外模擬消化過(guò)程中【胃30 min（G30）；腸30，60，90，120 min（I30，I60，I90，I120）】平均粒徑變化Fig.2 The average particle size of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion [gastric 30 min （G30）；intestinal 30，60，90，120 min （I30，I60，I90，I120）]

圖3 普通型和OPO 型油脂乳液體外模擬消化過(guò)程中【胃30 min（G30）；腸30，60，90，120 min（I30，I60，I90，I120）】zeta 電位的變化Fig.3 The zeta potential of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion [gastric 30 min（G30），intestinal 30，60，90，120 min （I30，I60，I90，I120）]

2.5 乳液體外模擬消化后甘油單酯和游離脂肪酸的組成分析

圖4顯示了兩種乳液體外模擬胃腸消化后，油脂水解釋放的FFA（圖4a）和產(chǎn)物MAG（圖4b）脂肪酸組成。二者水解生成的游離脂肪酸和甘油單酯的種類(lèi)基本相同，F(xiàn)FA 主要是油酸（C18：1）、棕櫚酸（C16：0）、亞油酸（C18：2）和硬脂酸（C18：0）；MAG 主要是棕櫚酸甘油酯、油酸甘油酯、亞油酸甘油酯和肉豆烯酸甘油酯。此外，OPO 型油脂生成的C18：1和C18：0相 比 于 初 始 酰 化 基 團(tuán) 的 比 例 增 加，C16：0相對(duì)減少；Oliveira 等[10]研究母乳消化過(guò)程中脂肪酸的組成也是類(lèi)似的結(jié)果。然而，普通型油脂正與之相反。OPO 型油脂的不飽和脂肪酸主要分布在sn-1，3 位，普通型的UFA 則主要在sn-2 位，根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5-6]以及脂肪酶的水解特異性，推測(cè)模擬胃腸消化后，普通型油脂生成較多的飽和游離脂肪酸和不飽和脂肪酸甘油單酯，OPO 型油脂生成的游離不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸甘油單酯含量較高，與圖中結(jié)果一致。OPO 型的水解生成O（C18：1），而P（C16：0）以甘油單酯形式被優(yōu)先吸收，體現(xiàn)在所測(cè)的sn-2 棕櫚酸甘油酯含量較高；而普通調(diào)和油型的生成P，因其熔點(diǎn)（63.1℃）高于體溫且容易與礦物質(zhì)形成沉淀，造成能量的損失，不利于人體消化吸收。

圖4 普通型和OPO 型油脂乳液體外模擬胃腸消化后游離脂肪酸（a）和甘油單酯（b）的脂肪酸組成Fig.4 Fatty acid composition of the free fatty acid （a） and of the sn-2 monoglycerides （b） during the gastro-intestinal lipolysis of the control emulsion and OPO emulsion in vitro digestion

2.6 乳液體外模擬消化過(guò)程中微觀結(jié)構(gòu)的分析

如圖5所示，對(duì)比二者，初始乳液，普通型出現(xiàn)一些較大顆粒，可能是因?yàn)槠溆椭埸c(diǎn)較OPO型低，被蛋白包埋的油脂發(fā)生遷移，導(dǎo)致乳液有絮凝和聚集現(xiàn)象[19]。普通型乳液在胃消化階段相對(duì)變化不大，很少量的絮凝，甚至沒(méi)有。而腸消化120 min 后，小粒子聚集，出現(xiàn)絮凝。OPO 型油脂在胃階段消化30 min 出現(xiàn)絮凝，結(jié)合上述脂肪酸的釋放率和粒徑結(jié)果，說(shuō)明出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要由于反應(yīng)釋放的產(chǎn)物在油滴表面附著，與初始乳化劑發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性吸附，導(dǎo)致粒子間空間位阻降低，容易結(jié)合在一起形成大粒子。腸消化120 min 后，絮凝被打破，而發(fā)現(xiàn)有油滴粒子間融合成大粒子現(xiàn)象，導(dǎo)致平均粒徑的增大。

兩者飽和與不飽和脂肪酸比例接近，這說(shuō)明脂肪酸在甘油三酯的位置分布，對(duì)消化體系的穩(wěn)定性有影響。相比OPO 型油脂，普通型油脂水解后主要生成更多的棕櫚酸和較少的油酸，棕櫚酸被中和后形成的脂肪酸鈉鹽，既對(duì)油滴有更強(qiáng)的附著力，造成體系不穩(wěn)定，同時(shí)它也易與鈣離子形成沉淀，而油酸被中和后易溶于水，不會(huì)過(guò)多附著在油滴表面。此外，油酸的熔點(diǎn)（16.3 ℃）比棕櫚酸（63.1 ℃）熔點(diǎn)低，更容易引起油滴間聚集[19]?？梢?jiàn)二者釋放出來(lái)的脂肪酸差異，影響其油滴表面的界面結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論

體外模擬消化過(guò)程中FFA 釋放率曲線表明，模擬胃消化30 min，普通型油脂乳液的消化程度大于OPO 型油脂乳液，而胃腸最終消化程度普通型油脂乳液消化程度大于OPO 型油脂乳液。消化過(guò)程中，OPO 型油脂乳液zeta 電位值要高于普通型油脂乳液，平均粒徑和微觀結(jié)構(gòu)圖像表明，消化中OPO 型油脂乳液先出現(xiàn)絮凝聚集。胃腸模擬消化后普通型油脂生成較多的飽和游離脂肪酸和不飽和脂肪酸甘油單酯，OPO 型油脂生成的游離不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸甘油單酯含量較高。綜合消化過(guò)程中平均粒徑、 電位變化以及共聚焦顯微圖像說(shuō)明脂肪酸的位置分布不同，水解產(chǎn)物不同，物化性質(zhì)不同，會(huì)影響消化中油滴的界面組成，微觀結(jié)構(gòu)變化，從而影響其油脂的消化利用。

圖5 普通型和OPO 型油脂乳液及其體外模擬胃消化30 min（G30 min）腸消化120 min （I120 min）的微觀結(jié)構(gòu)變化Fig.5 The confocal laser scanning microscopy images of the control emulsion and OPO emulsion during in vitro digestion