基于iTRAQ蛋白組學的植物乳桿菌鎘吸附及耐受特征分析

甘 雨 肖 越 翟齊嘯 趙建新 張 灝 陳 衛(wèi)

（江南大學食品學院 江蘇無錫214122）

隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染已成為世界性的問題[1]，其中我國行政區(qū)域內鎘超標率為33.2%，重金屬污染率為8.6%[2]。鎘是一種對人體健康有害的重金屬，它能通過食物被人體消化吸收[3]。微生物吸附是指微生物細胞經過一系列生物化學作用吸附溶液中的金屬或非金屬物質[4]。很多研究表明，某些微生物對重金屬離子有很強的吸附和富集能力，如細菌、放線菌、霉菌、酵母等都能從水溶液中吸附重金屬離子[5]。乳酸菌是一種普遍應用于食品工業(yè)的益生菌，在體外能結合并去除鎘、鉛等重金屬。Halttunen 等[6]比較了不同乳桿菌和雙歧桿菌對鉛和鎘的吸附能力，不同菌株對重金屬的吸附能力不同，其中動物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium lactis Bb12） 對鎘的吸附量達到（32.1±1.3）mg 鎘/g 干菌體。作者之前的研究表明，乳桿菌對重金屬鎘的吸附及耐受能力存在顯著的菌株差異，并篩選得到1 株強鎘吸附的植物乳桿菌菌株CCFM8610[7]。

微生物對鎘的吸附機制還未被全面闡釋。微生物吸附重金屬是一個復雜的過程，主要有兩種方式：生物體內富集和表面吸附[8]。金屬離子通過物理作用在微生物表面沉淀，主要通過范德華力，離子交換反應，靜電相互作用、絡合作用在生物表面吸附[9]。作者之前使用透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)鎘沉積在菌體表面，且鎘在表面的分布不連續(xù)[10]，說明菌體可能存在特殊的表面蛋白作為鎘吸附的位點。

蛋白質組學能夠鑒定和定量在生物系統(tǒng)中表達的蛋白質，常用的技術有雙向凝膠電泳、同位素相對標記與絕對定量（iTRAQ） 技術等，其中，i-TRAQ 技術有助于復雜樣本中低豐度蛋白質的識別和精確定量，從而增加了蛋白質識別和定量的處理量，同時減少了試驗誤差，并在蛋白質剖面分析方面呈現(xiàn)出較大的動態(tài)范圍[11]。Triboulet 等[12]用雙向凝膠電泳技術研究了小鼠巨噬細胞在銅與氧化銅納米顆粒處理后的蛋白組變化。Ma 等[13]用iTRAQ 技術分析了水稻在硅介導下的蛋白組變化，解釋了鎘耐受機制。

由于不同種乳桿菌代謝、 調控等生活方式的不同，其蛋白表達譜差異很大，直接比較不同鎘吸附能力乳桿菌的差異蛋白譜，無法規(guī)避菌株遺傳背景的干擾，因此作者在植物乳桿菌種內擴大篩選，得到1 株鎘吸附能力較弱的植物乳桿菌CCFM595，與課題組前期得到的強鎘吸附功能菌株CCFM8610 進行比較蛋白組學分析。作者篩選得到1 株弱鎘吸附能力的植物乳桿菌作為蛋白組學研究的對照，基于iTRAQ 的蛋白組學方法對兩株菌的差異蛋白進行功能注釋、 代謝通路重構以及互作網絡解析，旨在闡明強鎘吸附植物乳桿菌CCFM8610 的吸附機制。

1 試驗方法

1.1 試驗試劑

氯化鎘（CdCl2）等試劑，上海國藥化學試劑有限公司；Takara RR047A試劑盒，Takara Bio Inc（中國）；乙腈等蛋白提取和蛋白液質測定相關試劑均為色譜級，上海國藥試劑公司；iTRAQ 試劑，美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.2 菌株來源

21 株植物乳桿菌均來自江南大學食品生物技術中心菌種保藏中心。將菌株從甘油保菌管中取出后平板劃線，挑單菌落在37 ℃條件下MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代后，以2%接種量擴大培養(yǎng)，取穩(wěn)定期菌體進行吸附試驗。

1.3 具有不同鎘吸附能力的植物乳桿菌的篩選

將菌株以2%接種量接入含500 mL MRS 培養(yǎng)基的藍蓋瓶，培養(yǎng)結束后，8 000×g 離心10 min得菌體沉淀，用生理鹽水清洗沉淀2 遍，重復離心獲得菌體。將氯化鎘溶于生理鹽水，使溶液中鎘離子質量濃度達到50 mg/L，取0.4 g 濕菌體重懸于100 mL 氯化鎘溶液中。將菌懸液pH 值調至6.0，于37 ℃條件下200 r/min 搖床培養(yǎng)1 h，隨后8 000×g 離心10 min，取上清液用原子吸收分光光度計測定鎘濃度[14]。吸附試驗中每株菌重復4 個平行。

1.4 蛋白組分析

1.4.1 總蛋白提取 基于鎘吸附試驗的結果，選擇鎘吸附能力差異最大的兩株菌進行蛋白組分析。離心收集培養(yǎng)結束的菌體沉淀。將收集的菌體立即貯存在-80 ℃，以備蛋白提取。蛋白提取方法在文獻[15]的基礎上稍加改動。菌體經液氮研磨后，加入裂解液（4%SDS+100 mmol/L DTT）混勻；超聲破碎菌體，反復凍融。95 ℃恒溫混勻 5 min，20 000×g，4 ℃離心 30 min，取上清；用丙酮沉淀并清洗3 次；用裂解液 （7 mol/L 尿素+4%SDS）溶解蛋白，離心取上清。

1.4.2 蛋白樣品的制備和iTRAQ 標記 將從兩個菌株提取的蛋白（每個樣品100 μg）還原、烷基化、水解并用iTRAQ 試劑標記，然后用旋轉真空濃縮器將標記肽匯集并干燥。每個樣品用8 種i-TRAQ 試劑中的一種進行標記（CCFM8610 標記為113，114 和115；CCFM595 標記為116，117 和118）。每個樣品進行3 個生物學平行×2 個質譜上機的技術平行。

1.4.3 液相色譜-串聯(lián)質譜（LC/LC-MS/MS）分析液相色譜-串聯(lián)質譜分析參考了先前的研究[16]，并根據實際情況進行調整。用負載緩沖液（5 mmol/L 甲酸銨，含2%乙腈，pH=10）重新懸浮肽，并用高pH 反相液相色譜法（RPLC，Acquity Ultra Performance LC）分離。溶劑A 和溶劑B 分別為20 mmol/L 溶于水的甲酸銨 （pH=10） 與20 mmol/L 溶于100% 乙腈的甲酸銨（pH=10）。梯度洗脫是用0%～25%的B 液（5～35min）和25%～45%的B 液（35～48 min）在高pH 值的RPLC 柱（C18，3.5 μm，150 mm×2.1 mm）上進行。使用Nano Aquity UPLC 系統(tǒng)對收集的所有組分進行LCMS/MS 分析，該系統(tǒng)連接到配備在線納米電噴霧離子源的q-exactive 混合四極軌道質譜儀。將8 μL 的肽樣品加到Thermo Scientific Acclaim PepMap C18 柱（100 μm×2 cm；3 μm 粒徑）上，流速為10 μL/min，持續(xù)3 min。然后在分析柱上以線性梯度分離（Acclaim PepMap C18，75 μm × 15 cm），在45 min 內從5%的B 液到45%的B 液進行分離。用于分離的溶劑A 和溶劑B 分別為5%含0.1%甲酸的乙腈和95%含0.1%甲酸的乙腈。在初始條件下重新平衡柱15 min。柱流速保持在300 nL/min，柱溫度保持在40 ℃。使用1.9 kV 的電噴霧電壓。Q 型精密質譜儀以數(shù)據相關模式運行，在MS 和MS/MS 采集之間自動切換。測量全掃描MS 光譜（m/z 300～1 200）的質量分辨率為70 K，然后用分辨率為17.5 K 的MS/MS 掃描。

1.4.4 總蛋白的鑒定和差異蛋白的篩選 從LC/LC-MS/MS 得到的蛋白組數(shù)據處理使用軟件ProteinDiscovererTMSoftware 2.1 處理，數(shù)據庫選擇Uniprot 進行分析。鑒定得到的蛋白的功能采用Gene Ontology （GO）分析來注釋，代謝通路采用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） 數(shù)據庫來分析。采用單因素方差分析（ANOVA） 分析各組間的差異，之后進行圖基（Tukey）檢驗。P＜0.05 被認為存在統(tǒng)計學意義。變化倍數(shù)為＞2 或＜0.5。

2 試驗結果

2.1 具有不同鎘吸附能力的植物乳桿菌的篩選

21 株植物乳桿菌在50 mg/L 鎘離子水溶液中的吸附試驗結果如表1所示。

表1 不同植物乳桿菌對鎘離子的吸附情況Table1 Cadmium adsorption data of different Lactobacillus plantarum

由表1可以看出，鎘離子的吸附能力存在株間差異。其中CCFM8610 的吸附能力最強，每克干菌體能夠吸附19 mg 鎘離子。而CCFM595 的吸附能力最弱，每克干菌體能夠吸附4.95 mg 鎘離子。

2.2 兩株植物乳桿菌的總蛋白組特征

挑選在吸附試驗中的強鎘吸附菌株CCFM8610 和弱鎘吸附菌株CCFM595 進行蛋白組分析。將測得的全蛋白進行功能分析。采用GO（Gene Ontology） 分析注釋蛋白功能 （圖1a），用KEGG 分析注釋蛋白相關的代謝通路（圖1b），用COG 數(shù)據庫注釋得到功能分類（圖1c），以及通過檢測得到蛋白所含肽段數(shù)量的分布情況 （圖1d）。分析結果表明，蛋白對植物乳桿菌全基因組和相應功能有很高的覆蓋度。

2.3 兩株植物乳桿菌的差異蛋白組特征

在CCFM8610 和CCFM595 中共檢測得到1 690 個蛋白，其中差異倍數(shù)>2 且P＜0.05 的109個蛋白被選為差異表達蛋白。有89 個蛋白僅在CCFM8610 中檢測到。與作者之前的兩株菌的比較基因組分析結果相聯(lián)系，這89 個蛋白組分析中僅在CCFM8610 檢測到的蛋白，在兩株菌中都存在相應的編碼序列，即它們不是CCFM8610 特有的蛋白，而是相比CCFM595，在CCFM8610 中豐度更高而被檢測到的極端情況下的高表達蛋白。根據這些差異蛋白的KEGG 通路分析和其在Uniprot 數(shù)據庫中的注釋，它們被歸于轉錄調控，碳水化合物和脂質代謝，轉運蛋白，細胞表面蛋白等代謝通路中（圖2）。

圖1 植物乳桿菌CCFM8610 和CCFM595 中鑒定到的總蛋白的GO 功能分類（a）、KEGG 代謝功能分類（b）、COG 功能分類（c），以及肽段數(shù)量的分布情況（d）Fig.1 The GO functional classification（a），KEGG metabolic functional classification（b），COG functional classification（c） and number distribution of peptide segments（d） of total proteins identified in Lactobacillus plantarum CCFM8610 and CCFM595

圖2 植物乳桿菌CCFM8610 與CCFM595 的差異蛋白表達譜Fig.2 Differential protein expression profiles of Lactobacillus plantarum CCFM8610 and CCFM595

圖3 植物乳桿菌CCFM8610 與CCFM595 的差異蛋白互作網絡關系圖Fig.3 Protein-protein interaction network relationship of Lactobacillus plantarum CCFM8610 and CCFM595

將差異蛋白映射至蛋白關系網絡數(shù)據庫獲得蛋白的相互作用關系，使用string 軟件對差異蛋白進行網絡可視化。統(tǒng)計差異蛋白互作關系網絡的各種拓撲性質，可以獲得互作網絡中的關鍵節(jié)點（圖3）。圍繞關鍵節(jié)點的群聚蛋白具有相似的功能或參與同一通路。例如磷酸葡萄糖轉移酶系統(tǒng)（PTS）能夠特異地將葡萄糖從細胞外跨膜主動運輸進入細胞，并在此過程中，將葡萄糖磷酸化為葡萄糖-6-磷酸，進入糖酵解途徑，在圖中表現(xiàn)出以Pts1BCA 為關鍵節(jié)點的PTS 相關蛋白如Pts1BCA、Pts32A、Pts32BC 等與糖酵解通路中的6-磷酸-β-葡糖苷酶Pbg1、Pbg10 等具有很強的相互作用。除了該PTS 系統(tǒng)相關蛋白外，差異蛋白涉及的通路另外還包括圍繞關鍵蛋白RfbC 的胞外多糖合成相關蛋白集合（RfbC、RfbA、RfbB、RfbD），以TagF1 為中心的磷壁酸合成相關蛋白簇（TagF1、TagD1、DltC1），以關鍵節(jié)點PdhA 為特征的TCA循環(huán)相關蛋白簇（PdhA、PdhB、PdhC、PdhD），以及以Pox3 為代表的參與丙酮酸代謝的相關蛋白（Pox3、Pox5、Pox2）。

2.3.1 細胞壁及胞外聚合物 與細胞壁及胞外聚合物相關的16 個蛋白在CCFM8610 和CCFM595中差異表達。CCFM8610 中與細胞壁合成相關的蛋白、核糖磷壁酸合成相關蛋白、胞外蛋白、胞外多糖合成相關蛋白表達更高，而甘油磷壁酸合成相關蛋白表達更少。

表2 細胞壁及胞外聚合物合成通路中CCFM8610 和CCFM595 間的差異表達蛋白Table2 Differentially expressed proteins between CCFM8610 and CCFM595 in cell wall and extracellular polymer synthesis pathway

2.3.2 轉運蛋白 31 個轉運蛋白在CCFM8610和CCFM595 中差異表達。16 個與糖轉運相關蛋白，如PTS 轉運系統(tǒng)及ABC 轉運蛋白在CCFM595 中表達更多。氨基酸、甘油和離子轉運相關蛋白在CCFM8610 中表達更多。

表3 CCFM8610 和CCFM595 間轉運相關差異表達蛋白Table3 Differentially expressed proteins involved in transportation between CCFM8610 and CCFM595

（續(xù)表3）

2.3.3 能量代謝 37 個能量代謝相關蛋白在CCFM8610 和CCFM595 中差異表達。糖酵解、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝相關蛋白在CCFM595 中表達更多，磷酸戊糖途徑和多糖合成在CCFM8610中表達更多。CCFM8610 中與呼吸鏈相關，如NADH 脫氫酶的6 個蛋白中大部分表達高于CCFM595。

表4 能量代謝通路中CCFM8610 和CCFM595 間的差異表達蛋白Table4 Differentially expressed proteins between CCFM8610 and CCFM595 in energy metabolic pathway

（續(xù)表4）

2.3.4 脂代謝、醇代謝、氨基酸、核酸代謝及轉錄與CCFM8610 相比，有4 個脂代謝相關蛋白在CCFM595 中表達更高。與肌醇代謝相關的2 個蛋白在CCFM595 中表達更高，與乙醇合成相關的蛋白表達更低。

賴氨酸、鳥氨酸代謝相關蛋白在CCFM595 中表達更多，而芳香族氨基酸合成相關蛋白如3-脫氫奎寧酸脫水酶及其它氨基酸代謝相關蛋白如核糖磷酸焦磷酸激酶、 胱硫醚-β-裂解酶等在CCFM8610 中表達更多。CCFM8610 中8 個蛋白代謝相關蛋白表達高于CCFM595。

與CCFM595 相比，核酸代謝相關蛋白，如腺嘌呤脫氨酶、 環(huán)核苷酸磷酸二酯酶等在CCFM8610 中表達更高。轉錄相關蛋白及轉錄調控因子在CCFM8610 中表達高于CCFM595，而與CCFM8610 相比，參與質粒轉錄調控的2 個蛋白在CCFM595 中表達更多。

表5 其它代謝及調控通路中CCFM8610 和CCFM595 間的差異表達蛋白Table5 Differentially expressed proteins between CCFM8610 and CCFM595 in other metabolic and regulatory pathways

（續(xù)表5）

2.3.5 壓力應答 與CCFM8610 相比，9 個壓力應答相關的蛋白在CCFM595 中表達更高，分別于熱應激、堿應激及過氧化應激相關，壓力應答相關蛋白在總差異蛋白中的比例約為8%。

表6 壓力應答通路CCFM8610 和CCFM595 間的差異表達蛋白Table6 Differentially expressed proteins between CCFM8610 and CCFM595 in stress response pathway

3 討論

為了研究植物乳桿菌鎘吸附種內差異的潛在機制，采用基于iTRAQ 方法的蛋白組學比較CCFM8610（高吸附菌株）和CCFM595（低吸附菌株）的蛋白圖譜。通過對這些差異蛋白進行功能注釋、代謝通路重構以及互作網絡解析，最終發(fā)現(xiàn)細胞壁及胞外聚合物、 金屬離子轉運蛋白、 壓力應答、能量代謝、氨基酸代謝、核酸代謝及轉錄等通路與CCFM8610 的強鎘吸附能力相關（圖4）。

3.1 細胞壁及胞外聚合物

研究表明，細菌的細胞壁是吸附重金屬的主要部位，紅外光譜顯示細胞壁上的氨基、羧基及磷酸基團是吸附重金屬的主要位點[17]。之前，通過細胞組分剝離及透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，CCFM8610 吸附鎘的主要位點為細胞表面，只有7%的鎘進入細胞內部[18]。

磷壁酸是革蘭氏陽性（G+）菌細胞壁上一種特殊組分。研究表明，磷壁酸能夠提供大量磷酸基團，是結合金屬離子的重要物質，提取磷壁酸后，細胞壁結合金屬離子的能力顯著降低[19]。磷壁酸由核糖醇或甘油殘基經由磷酸二鍵互相連接而成，分為核糖醇磷壁酸和甘油磷壁酸。CCFM8610與合成甘油磷壁酸相關蛋白的表達高于CCFM595，而與合成核糖醇磷壁酸相關蛋白的表達低于CCFM595。在細胞壁中，核糖醇磷壁酸與Mg2+離子的親和力比甘油磷壁酸強[20]。CCFM8610 菌株中與細胞壁合成相關的蛋白RfbB 與RfbC 的表達均高于CCFM595，說明CCFM8610 的細胞壁合成更為活躍，結合鎘的潛力大。這是CCFM8610 吸附能力高的可能原因。

圖4 CCFM8610 對鎘刺激的可能應答網絡Fig.4 Presumed CCFM8610 response network to cadmium exposure

胞外聚合物（EPS） 是微生物分泌于體外的高分子聚合物，如多糖、蛋白質等。研究表明胞外多糖與胞外蛋白也有結合重金屬的能力[21]。CCFM8610 與分泌胞外多糖相關的蛋白RfbA、Glf2 和RfbD 表達高于CCFM595，且CCFM8610還會分泌更多的胞外蛋白如lp_3077、lp_0141 和lp_0574，說明CCFM8610 可能通過分泌胞外多糖及蛋白阻止鎘進入細胞內部，同時將鎘吸附并沉積，這也是CCFM8610 表現(xiàn)出高吸附的原因。另外基因組分析表明，與CCFM595 相比，CCFM8610具有額外的胞外多糖合成基因元件（epsD_1、epsF_1、epsJ 和epsL），印證了蛋白組的結果。

3.2 金屬離子轉運

與CCFM595 相比，鎘離子外排泵CadA[22]、Mg2+/Co2+轉運蛋白lp_2565 在CCFM8610 中表達更高。cadA 在枯草芽孢桿菌[23]、大腸桿菌[24]中都有過研究。Mg2+等金屬元素的轉運系統(tǒng)也可以轉運重金屬[25]，說明lp_2565 可能起到鎘外排的作用。Nha2 蛋白可以通過外排鈉離子交換其它金屬離子，它在CCFM8610 中的表達更低，說明CCFM8610 是通過將鎘離子外排并減少金屬離子攝入的機制阻止鎘離子進入細胞，同時鎘在外排泵附近沉積，這也解釋了鎘的沉積物在CCFM8610 細胞表面不連續(xù)分布。

3.3 壓力應答

CCFM8610 菌株中與壓力應答相關的蛋白表達均低于CCFM595，說明CCFM8610 細胞一直處于低壓力的狀態(tài)。Npr2、Kat 為植物乳桿菌參與過氧化氫應激過程的關鍵蛋白[26]；谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合，含有巰基的三肽，對細胞內的活性氧有解毒作用[27]，GshR2 為谷胱甘肽還原酶，當植物乳桿菌被高濃度過氧化氫處理后，它的表達顯著上升[28]；Dps1 可以保護細胞DNA 免受活性氧的損傷，它與DNA 結合以減少羥基自由基誘導的單鏈斷裂的數(shù)量，并通過作為物理屏障保護DNA 免受損傷[29]；mrsA/B 可以修復被氧化損傷的蛋白質[30]，這些蛋白的表達可以緩解鎘離子帶來的氧化損傷。甜菜堿是一種滲透保護物質，它在亞碲酸鹽壓力下含量上升[31]。甜菜堿轉運蛋白lp_3324 在CCFM8610 中表達高于CCFM595，它能夠調節(jié)滲透壓，在NaCl 壓力下表達上升[32]，說明CCFM8610 細胞的滲透壓可以根據外界環(huán)境的變化進行調節(jié)。另外，聯(lián)系兩株菌的比較基因組結果，CCFM8610 具有特有的cas 系統(tǒng)相關基因（cas1、cas2、cas3），同時在蛋白組分析中僅在CCFM8610 中檢測得到兩個前噬菌體蛋白（前噬菌體 P1 蛋白 10 以及前噬菌體P1 蛋白2）。而菌株的噬菌體抵抗由cas 系統(tǒng)所決定，兩個組學的結果相互印證。

3.4 能量代謝

CCFM8610 與CCFM595 的糖代謝模式有顯著區(qū)別。CCFM8610 中參與三羧酸（TCA）循環(huán)的蛋白表達低，而與磷酸戊糖途徑相關的蛋白含量高，且呼吸鏈相關蛋白表達更多。CCFM8610 中pdh操縱子的抑制表明了菌體從TCA 循環(huán)到支鏈代謝的轉換[33]，這說明CCFM8610 具有獨特的能量節(jié)省的代謝模式。磷酸戊糖途徑代謝能夠產生大量的NADPH，為細胞的各種合成反應提供還原劑，并且該途徑的中間產物可以為許多物質的合成提供原料。這說明CCFM8610 菌體自身的生物合成能力強，對外界獲取的營養(yǎng)要求相對低。CCFM8610 中大部分與糖轉運相關的蛋白，如磷酸轉移酶系統(tǒng)（PTS）表達低于CCFM595，這進一步支持了上述觀點，印證了CCFM8610 能量低耗的生存模式。CCFM8610 中的半乳糖苷酶LacM，木糖操縱子調控蛋白XylR 表達高于CCFM595，說明CCFM8610 具有多種糖類代謝能力。據報道，細菌在苯胺壓力下戊糖磷酸途徑與糖異生途徑相關蛋白表達增加，且半乳糖及木糖含量上升，碳代謝通路變?yōu)楸磉_更多糖類物質如胞外多糖的合成來抵抗環(huán)境壓力[34]，這也與CCFM8610 自身物質合成能力強的特性相符。

3.5 脂代謝與氨基酸代謝

CCFM8610 的脂質代謝相關蛋白表達均低于CCFM595，如acpA2 為脂肪酸合成酶，lp_2923 與脂質水解相關。而細菌細胞膜脂肪酸代謝更高，表示對環(huán)境壓力的耐受能力上升[35]，CCFM8610 的細胞膜脂肪酸代謝更低，推測可能是細菌通過降低細胞膜流動性，減少鎘離子進入細胞內。

與CCFM595 相比，谷氨酰胺?；D移酶lp_3142、 組氨酸合成相關蛋白HisE 與半胱氨酸合成相關酶CblA2 在CCFM8610 中表達更高。Cd暴露后枯草芽孢桿菌中組氨酸降解減少[36]，而在植物細胞中谷氨酸的積累是作為細胞中的滲透保護劑應對Cd 毒性，組氨酸則在金屬結合中起到作用[37]。這說明CCFM8610 通過調節(jié)滲透壓抵御鎘毒性。半胱氨酸具有巰基基團，而鎘離子優(yōu)先結合硫配基[38]，這可以被視為CCFM8610 細胞內部具有更多的可結合鎘離子的蛋白。AroA、AroD 是CCFM8610 芳香族氨基酸合成相關酶，芳香族氨基酸有很強的疏水性，在菌體表面表達能夠形成疏水區(qū)域來防止鎘暴露導致的細胞損害[39]，這也是CCFM8610 具有鎘耐受能力的原因。

3.6 轉錄

與CCFM595 相比，嘧啶二聚體DNA 糖基化酶lp_3573 在CCFM8610 中表達更高，它能夠識別嘧啶二聚體并將N-糖苷鏈切除，制造AP 位點，CCFM8610 的堿基切除修復能力能夠應對鎘毒性造成的DNA 損傷。RepB 為質粒拷貝數(shù)控制蛋白，Orf1 為質粒復制起始蛋白，由于很多抗逆性基因存在于質粒上[40]，這兩個蛋白在CCFM595 中表達更多，說明CCFM595 可能通過表達質粒上的抗逆蛋白來抵抗環(huán)境壓力。

4 結論

綜上分析，CCFM8610 和CCFM595 鎘吸附及耐受的種內差異的潛在機制可能被歸因為以下幾個方面。1）CCFM8610 細胞壁更容易與鎘離子結合，并分泌大量胞外蛋白及胞外多糖使鎘離子沉淀在細胞外部。這使CCFM8610 在對鎘離子有高吸附的同時阻隔鎘離子進入細胞內部。2）CCFM8610細胞一直處于低壓力的狀態(tài)，表現(xiàn)為壓力應答相關蛋白在CCFM8610 中低表達。3）CCFM8610 具有獨特的能量節(jié)省的代謝模式，表現(xiàn)為TCA 循環(huán)通路蛋白的整體較低水平，磷酸戊糖途徑代謝更強。4）具有強的金屬外排轉運能力，表現(xiàn)為CadA等鎘外排泵也在CCFM8610 具有更高的豐度，減少鎘離子對細胞的損傷。5）CCFM8610 的疏水性氨基酸的表達增加，可增大細胞的表面疏水性，還能通過表達調節(jié)滲透壓及胞內結合鎘的氨基酸來應對鎘毒性。本研究提出植物乳桿菌鎘吸附及耐受網絡的概貌以及強鎘吸附菌株CCFM8610 的鎘吸附耐受機制。