艾拉莫德增強(qiáng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的人食管癌Eca109細(xì)胞凋亡

吳昱 王甲林

食管癌（esophageal cancer，EC）是常見的消化道腫瘤，是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。世界上79%的食管癌發(fā)生在中亞和東南亞，食管癌已成為中國第四大常見臨床診斷癌癥，也是中國癌癥相關(guān)死亡的三大主要原因之一[2]。即使采用聯(lián)合手術(shù)、化療和放療，食管癌的5年生存率＜ 20%，因此，增強(qiáng)食管癌放療和化療的敏感性是改善食管癌患者預(yù)后的重要途徑[3]。

艾拉莫德是一類新型的抗風(fēng)濕類藥物（diseasemodifying anti-rheumatic drugs，DMARDs），具有免疫調(diào)節(jié)功能。研究顯示，艾拉莫德能夠促進(jìn)單核細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫能力[4]，但艾拉莫德在食管癌中的作用機(jī)制未見報(bào)道。本研究探討艾拉莫德對(duì)食管癌增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制。

材料和方法

一、材料

（一）細(xì)胞系

人食管癌細(xì)胞系Eca109（購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫）

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國Gibico公司），絲裂霉素C（浙江海正藥業(yè)股份有限公司），艾拉莫德T-614（先聲藥業(yè)有限公司），CCK8（美國sigma公司），活性氧檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物科技有限公司），caspase3剪切體（cleaved caspase3）兔單抗，腫瘤壞死因子α（TNFα）兔單抗（美國CST公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)與處理

人食管癌細(xì)胞系Eca109用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每2天換1次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合至80%以上傳代培養(yǎng)。

6孔板接種Eca109細(xì)胞，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%～ 80%的時(shí)候，進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。對(duì)于CCK8和細(xì)胞活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為 8 組，分別為 0，25，50，100 μg/ml濃度艾拉莫德（T-614）以及 0，25，50，100 μg/ml濃度艾拉莫德（T-614）+MMC（50 μg/ml），其中 0 μg/ml艾拉莫德為等體積的DMSO溶液。對(duì)于細(xì)胞凋亡和Western Blot實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為4組，分別為對(duì)照組、T-614（50 μg/ml）組、MMC（50 μg/ ml）組和 T-614（50 μg/ml）+MMC（50 μg/ml）組，其中對(duì)照組為加入等體積的DMSO代替T-614。于37 ℃、5%CO2正常培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、Western Blot和細(xì)胞活性氧檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

（二）CCK8法檢測(cè)細(xì)胞死亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人食管癌細(xì)胞Eca109，0.25%胰酶消化離心，接種5×103個(gè)細(xì)胞于96孔板中，每孔200 μl體積，按上述分組處理培養(yǎng)，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl體積的CCK8工作液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2.5 h后，于酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)定吸光值（A450），用A450值代表細(xì)胞活力。

（三）流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集艾拉莫德T-614、絲裂霉素MMC和T-614+MMC聯(lián)合處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109，離心洗滌后按照試劑盒操作說明書加入流式緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，4 ℃避光孵育 30 min，再加 5 μl PI染液，孵育 5 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)波長(zhǎng) Ex = 488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em = 530 nm，細(xì)胞凋亡率為早期凋亡（Q4）和晚期凋亡（Q2）細(xì)胞所占的比例數(shù)總和。

（四）Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

取T-614、MMC和T-614+MMC聯(lián)合處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109，加入蛋白裂解液收集細(xì)胞蛋白樣品，定量后取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入（1 : 500）稀釋的一抗（TNFα，cleaved caspase3，GAPDH），室溫孵育1 h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗滌后加入顯色液，成像拍照后進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

（五）細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè)

收集不同處理后的人食管癌細(xì)胞Eca109，用PBS洗滌細(xì)胞2次，并與10 μmol/L二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）工作液（1 : 1000稀釋）在37 ℃下孵育30 min。隨后將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并通過熒光酶標(biāo)儀分析，488 nm激發(fā)波長(zhǎng)，525 nm發(fā)射波長(zhǎng)。細(xì)胞內(nèi)ROS水平表示為細(xì)胞的DCFH平均熒光強(qiáng)度。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)CCK8、細(xì)胞凋亡、ROS檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)數(shù)據(jù)均采用表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、艾拉莫德抑制人食管癌Eca109細(xì)胞活力

CCK8結(jié)果所示，與0 μg/ml T-614組A450值（1.05±0.05）相比，50，100 μg/ml T-614 組A450 值（0.82±0.08，0.55±0.05）降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 35.73，P＜ 0.01）。 與 0 μg/ml T-614+MMC組A450 值（0.85±0.03）比 較，25、50、100 μg/ml T-614+MMC 組A450 值（0.73±0.02，0.52±0.02，0.33±0.02）均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=127.60，P＜ 0.01）。這表明艾拉莫德 T-614 能夠增強(qiáng)MMC對(duì)人食管癌Eca109細(xì)胞活力的抑制能力。（表1）

二、艾拉莫德促進(jìn)食管癌Eca109細(xì)胞活性氧生成

細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 μg/ mL T-614組 DCFH 熒 光 值（35.00±5.00）相 比，50、100 μg/ml T-614 組 DCFH 熒 光 值（90.00±10.00，136.67±15.28）升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 74.71，P＜ 0.01）。與 0 μg/ml T-614+MMC組 DCFH 熒 光 值（130.00±10.00）比 較，25，50，100 μg/ml T-614+MMC 組 DCFH 值（219.67±9.50，280.33±10.50，338.33±16.07）均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 170.20，P＜ 0.01）。（表2）

表1 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后CCK8檢測(cè)Eca109細(xì)胞A450值（± s）

表1 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后CCK8檢測(cè)Eca109細(xì)胞A450值（± s）

注：與 0 μg/ml組比較，aP ＜ 0.05

T-614分組濃度 樣本數(shù) T-614（A450） T-614+MMC（A450）0 μg/ml 31.05±0.050.85±0.0325 μg/ml 30.98±0.080.73±0.02a 50 μg/ml 30.82±0.08a 0.52±0.02a 100 μg/ml 30.55±0.05a 0.33±0.02a F值 35.73127.60 P值 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001

表2 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后DCFH法檢測(cè)Eca109細(xì)胞DCFH熒光值（± s）

表2 不同濃度T-614和T-614+MMC處理后DCFH法檢測(cè)Eca109細(xì)胞DCFH熒光值（± s）

注：與 0 μg/ml組比較，aP ＜ 0.05

T-614分組濃度 樣本數(shù) T-614（DCFH） T-614+MMC（DCFH 0 μg/ml 335.00± 5.00130.00±10.0025 μg/ml 341.67± 1.53219.67± 9.50a 50 μg/ml 390.00±10.00a 280.33±10.50a 100 μg/ml 3136.67±15.28a 338.33±16.07a F值 74.71170.20 P值 ＜ 0.0001 ＜ 0.0001

三、艾拉莫德誘導(dǎo)食管癌Eca109細(xì)胞凋亡

如圖1流式檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率（5.33±0.35） %比較，T-614和MMC組的凋亡率（20.30±2.00） %，（25.60±3.00）%均升高。與MMC組細(xì)胞凋亡率（25.60±3.00） %比較，艾拉莫德與MMC聯(lián)用組（T-614+MMC）食管癌Eca109細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率（56.20±3.00） %升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 247.50，P＜ 0.01）。（圖 2）

四、艾拉莫德對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組TNFα和 cleaved caspase3蛋 白 表達(dá) 量（0.45±0.05，0.13±0.03）相比，T-614 組（0.85±0.05，0.25±0.02）和 MMC 組（0.87±0.06，0.25±0.03）Eca109 細(xì)胞 TNFα和 cleaved caspase3蛋白表達(dá)量升高（P＜0.01）。與 MMC 組（0.87±0.06，0.25±0.03）相比，艾拉莫德與MMC聯(lián)用組（T-614+MMC）食管癌Eca109細(xì)胞TNFα和cleaved caspase3蛋白表達(dá)（1.28±0.08，0.59±0.03）升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 96.90，P＜ 0.01）。（圖 3）

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖2 艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡的影響

圖3 艾拉莫德對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

討 論

食管癌系指由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變[5]。世界每年死于食管癌者約為20萬人。中國為食管癌高發(fā)國家，每年死于食管癌者約占中國惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/5[6]。早期食管癌患者應(yīng)首選手術(shù)治療。對(duì)中、晚期癌除作手術(shù)治療外，可采用放射治療、化學(xué)治療等[7]。目前雖應(yīng)用于食管癌的化療藥物較多，但確有療效者不多，其中最常用的藥物為絲裂霉素C（MMC）。聯(lián)合化療不僅用于中晚期食管癌，也用于與手術(shù)和放療的綜合治療[8]。因此，聯(lián)合化療方案可能是治療食管癌的重要方法。

艾拉莫德是一類新型的小分子抗風(fēng)濕類藥物，是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的小分子化合物[9]。研究表明，艾拉莫德通過抑制過氧化物酶體增殖物激活的受體-γ來抑制破骨細(xì)胞生成[4]。最新研究表明，艾拉莫德在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過程中，能夠誘導(dǎo)患者外周血單核細(xì)胞的凋亡[10]。本研究推測(cè)艾拉莫德對(duì)食管癌也具有影響，基于該推論，本研究通過CCK8實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了艾拉莫德及其靶基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果顯示艾拉莫德能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這與之前的研究結(jié)果一致。

ROS主要在線粒體中產(chǎn)生，作為正常細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，ROS具有介導(dǎo)正常生理信號(hào)傳導(dǎo)的重要作用[11]。在正常生理?xiàng)l件下，ROS的生理水平刺激細(xì)胞增殖和存活，而ROS水平升高可損害許多細(xì)胞成分，例如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)和DNA，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[12]。ROS被認(rèn)為是調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中細(xì)胞死亡和存活的重要信使分子，ROS濃度的變化在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，被認(rèn)為是癌癥治療中有希望的治療方法[13]。艾拉莫德對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響還沒有研究證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖，進(jìn)一步檢測(cè)了艾拉莫德對(duì)食管癌細(xì)胞ROS生成的影響。結(jié)果顯示，艾拉莫德能夠促進(jìn)食管癌細(xì)胞ROS生成，表明艾拉莫德抑制食管癌細(xì)胞活力可能與促進(jìn)食管癌細(xì)胞ROS生成有關(guān)。

細(xì)胞凋亡失調(diào)已被認(rèn)為是癌癥發(fā)展的最重要的生物學(xué)特征之一。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行需要半胱天冬酶蛋白家族的精確協(xié)調(diào)[14]。Caspase-3，也稱為死亡酶，在程序性細(xì)胞死亡的受控執(zhí)行階段起關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡信號(hào)引起細(xì)胞色素C的釋放，激活caspase-3，啟動(dòng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)的，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。TNF-α是一種具有高免疫能力的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖和凋亡，與多種炎癥性疾病和癌癥有關(guān)[16]。已經(jīng)證明TNF-α在癌癥的發(fā)生發(fā)展和治療中起相反作用。研究表明TNF-α通過與腫瘤細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。TNF-α還可通過激活信號(hào)通路，包括 ERK，p38MAPK、NF-κB 和caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-20]。有研究表明，TNF-α能刺激活性氧（ROS）的釋放，消耗細(xì)胞谷胱甘肽，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡[21]。本研究發(fā)現(xiàn)艾拉莫德能夠誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步檢測(cè)了cleaved caspase 3和TNF-α的表達(dá)水平，結(jié)果顯示艾拉莫德能夠促進(jìn)cleaved- caspase 3的表達(dá)水平，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF- α的表達(dá)，表明艾拉莫德促進(jìn)食管癌細(xì)胞凋亡可能與TNF-α和線粒體凋亡通路有關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了艾拉莫德能夠增強(qiáng)絲裂霉素對(duì)人食管癌細(xì)胞Eca109的細(xì)胞活力的抑制作用，并且促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。艾拉莫德能夠促進(jìn)絲裂霉素誘導(dǎo)的人食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞凋亡，并且能夠抑制細(xì)胞因子TNF-α和凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平。艾拉莫德調(diào)控食管癌細(xì)胞Eca109細(xì)胞增殖和凋亡可能與IL-6和TGF-β的表達(dá)以及線粒體凋亡通路有關(guān)，其作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。本課題研究結(jié)果有助于了解艾拉莫德在食管癌治療中的作用，為食管癌的治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。