禽腺病毒-I群PCR-RFLP分型方法的建立

江之瑤 ， 王守春 ， 欒慶東 , 尹燕博 ， 王建琳

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 山東 青島 266109)

禽腺病毒按照特異性抗原的不同可分為3個群，其中禽腺病毒-I群(Fowl adenovirus, FAdVs)共分為12個血清型(1～7、8a、8b、9～11)，F(xiàn)AdVs能引起禽心包積液綜合征、包涵體肝炎、肌胃糜爛和再生障礙性貧血等[1]。FAdVs不僅可以水平傳播，還可以垂直傳播，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅[2]。目前，檢測FAdVs的經(jīng)典方法主要有病毒的分離鑒定、病毒中和試驗等。在實際生產(chǎn)中，以分子生物為基礎(chǔ)的PCR檢測方法是進(jìn)行病原測定的主要方法[3]，但單純的PCR檢測方法無法區(qū)分FAdVs的血清型，需要后續(xù)進(jìn)行基因測序分析等。

自2015年以來，F(xiàn)AdVs感染在我國廣泛流行，尤其血清4型FAdVs給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。我國FAdVs感染有多種血清型，為快速準(zhǔn)確的區(qū)分不同血清型 FAdVs感染，為后續(xù)的有效防控提供依據(jù)，本試驗擬建立FAdVs的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism,PCR-RFLP)分型方法，用于臨床FAdVs的快速分型。

1 材料與方法

1.1 毒株、載體與細(xì)胞 FAdVs的12個血清型 (購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；感受態(tài)細(xì)胞 DH5α和pMD18-T 載體(TaKaRa公司)。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F-12細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、LB培養(yǎng)基、DNA Maker DL-2 000(TaKaRa公司)； DEPC水(北京索萊寶科技有限公司)；1×PCR Mix；DNAiso Plus(TaKaRa公司)；氯仿、異丙醇、乙醇(天津化學(xué)試劑三廠)。PCR基因擴(kuò)增儀(TC-96/G/H(b)型，杭州博日公司)，電泳儀(JY600E型，君意東方公司)， 核酸電泳槽(JY-SPFT型，君意東方公司)，凝膠成像儀(JY04S-3C型，君意東方公司)，恒溫水槽(HH.S11-2型，上海博訊公司)，超純水儀(best-R型，上海芷昂公司)，離心機(jī)(Pico17型，ThermoFisher公司)，恒溫培養(yǎng)箱(XT5116-IN70型，雪中炭公司)。

1.3 限制性內(nèi)切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、Psy I、BgⅡ(Thermo Fisher公司)。

1.4 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中 FAdV-I的Hexon基因，應(yīng)用Premier5.0軟件設(shè)計通用引物(表1)，并尋找酶切位點，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 Hexon基因擴(kuò)增用引物

1.5 病毒核酸提取與PCR擴(kuò)增 取細(xì)胞毒上清200 μL，加入700 μL DNAisoPlus、140 μL 氯仿。輕柔混勻，室溫靜置10 min。12 000 r/min離心10 min,取上清500 μL，加入500 μL冷異丙醇。低溫靜置10 min。12 000 r/min離心 10 min 棄上清。加入1 000 μL冷75%乙醇，7 500 r/min離心5 min后棄上清，重復(fù)操作2次。室溫敞口干燥，確保乙醇揮發(fā)干凈后加入DEPC 水35 μL，輕彈，使核酸徹底溶解，置于-80 ℃冰箱備用。

PCR反應(yīng)體系為PCR Mix 45 μL,模板1 μL，上下游引物各2 μL。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR結(jié)束后，電泳鑒定連接載體并測序。

1.6 目的基因的酶切及圖譜分析 取PCR產(chǎn)物7 μL，加入DEPC 水10 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，10×Fast Digest Buffer 2 μL。于恒溫箱中37 ℃酶切30 min。電泳確認(rèn)酶切結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 毒株擴(kuò)增和測序結(jié)果 利用本試驗所設(shè)計的引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，F(xiàn)AdVs的12個血清型均得到了與預(yù)期條帶大小一致的片段，約894 bp(圖1)，連接載體測序結(jié)果為FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)型。經(jīng)序列分析，各毒株的片段與GenBank中所登錄的FAdVs的同源性和覆蓋率均為98%～100%。

圖1 12個血清型FAdV-I Hexon基因PCR擴(kuò)增結(jié)果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1～12:FAV1-7、8a、8b、9-11PCR產(chǎn)物

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切電泳結(jié)果與分析 FAdVs(1～7、8a、8b、9～11)Hexon基因894片段的限制性內(nèi)切酶酶切位點分析發(fā)現(xiàn)，Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI、PsyI、BgⅡ組合酶切后有良好的特異性，能有效區(qū)分全部12個血清型。

12種血清型FAdVs的PCR片段的Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ組合酶切結(jié)果見圖2、圖3和圖4。片段經(jīng)Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ組合酶切后得到了12種RFLP圖譜，可以區(qū)分出12種血清型的FAdVs，酶切結(jié)果與軟件分析結(jié)果一致。

圖2 FAV-I Hexon基因擴(kuò)增片段Pf 123Ⅱ和BgⅡ酶切結(jié)果
M: DNA Marker DL-2 000 ; 左側(cè)1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴(kuò)增片段的Pf123Ⅱ酶切結(jié)果 ; 右側(cè)1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVs 的BgⅡ酶切結(jié)果

圖3 FAdVs Hexon基因擴(kuò)增片段Eco130 I和Mlu I酶切結(jié)果
M:DNA Marker DL-2 000 ; 左側(cè)1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴(kuò)增片段的Eco130 I酶切結(jié)果 ; 右側(cè)1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴(kuò)增片段的MluI酶切結(jié)果

圖4 FAdVs Hexon基因擴(kuò)增片段Psy I酶切結(jié)果
M:DNA Marker DL-2 000; 1～7、8a、8b、9～11:12個血清型FAdVsHexon基因擴(kuò)增片段的PsyI酶切結(jié)果

2.3 臨床樣本測定 本實驗室2株(RZ株、YTPL株)臨床分離株經(jīng)Hexon全基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序確認(rèn)為FAdVs-4和FAdVs-11。這2個毒株應(yīng)用上述建立的PCR-RFLP方法進(jìn)行測定，得到酶切圖譜(圖5、圖6)，經(jīng)分析比對其圖譜條帶與FAdVs中的FAdVs-4、FAdVs-11型的酶切圖譜相符合。

圖5 RZ株酶切圖譜
M:DNA Marker DL-2 000 ; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI ;3:Eco130 I ; 4:MluI ; 5:BgⅡ

3 討論

FAdVs共有12個血清型(FAdVs 1～7、8a、8b、9～11)，多數(shù)血清型的腺病毒都能引起禽類嚴(yán)重的疾病，不同血清型的腺病毒致病性和所引起的癥狀不完全相同[4]。FAdVs還容易與新城疫病毒、雞傳染性貧血病毒、傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒和大腸桿菌等病原混合感染，對家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[5]。由于不同血清型的FAdVs之間有不同程度的交叉中和作用[6]，所以以血清學(xué)方法為基礎(chǔ)的分型方法尚未建立[7]。本試驗建立的方法與序列測定相比較更加簡便、快捷。本試驗中所設(shè)計的引物能良好的擴(kuò)增出FAdVs全部12種血清型，以該引物為基礎(chǔ)的PCR-RFLP有良好的通用性。

圖6 YTPL株酶切圖譜
M:DNA Marker DL-2 000; 1:Pf123Ⅱ; 2:PsyI;3:Eco130 I; 4:MluI; 5:BgⅡ

Zsak等[8]利用BamH I和HindIII對FAdVs進(jìn)行PCR-RFLP分析，將FAdVs分為5種不同的A～E亞群，研究表明有一定致病性的禽腺病毒毒株之間的基因型具相關(guān)性。其中A亞群包含F(xiàn)AdVs-1；B亞群含F(xiàn)AdVs-5；C亞群含F(xiàn)AdVs-4；D亞群包含F(xiàn)AdVs-2、FAdVs-3、FAdVs-9和FAdVs-11；E亞群包含F(xiàn)AdVs-6、FAdVs-7、FAdVs-8a和FAdVs-8b，但其方法不能將全部血清型的FAdVs區(qū)分。李海英等[9]根據(jù)Hexon全基因的酶切位點，建立了利用限制性內(nèi)切酶HaeⅡ分型方法，能區(qū)分FAdVs；但該方法需要擴(kuò)增Hexon基因的全長，約2 500 bp，且該方法所得到的酶切圖譜可以區(qū)分出FAdVs-3、4、6、8 b、9、10 這6種血清型，而FAdVs-1、2、5、7、8a和11這6種血清型由于酶切條帶太過接近，無法區(qū)分，故該方法無法完全區(qū)分出FAdVs的 12個血清型。而本試驗中同樣擴(kuò)增FAdVsHexon基因，但其片段長度較短，易于擴(kuò)增；且選用限制性內(nèi)切酶Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI、BgⅡ?qū)U(kuò)增片段進(jìn)行酶切分析，酶切圖譜區(qū)分度良好，能很好地區(qū)分出FAdVs的12個血清型。G.Meulemans等[10]使用與本試驗相同的引物，對FAdVs的Hexon基因進(jìn)行擴(kuò)增，并對所得到的PCR產(chǎn)物利用BsiW I、Sty1、MluI、AspI、ScaI和BgⅡ這6種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，所得到的酶切圖譜可以將12個血清型的FAdVs區(qū)分。與該報道相比，本試驗只需要Eco130 I、Pf123Ⅱ、MluI 、PsyI和BgⅡ這5種限制性內(nèi)切酶即可完成酶切，故更具有簡便性。

為簡化操作，本試驗采用統(tǒng)一溫度、統(tǒng)一反應(yīng)時間進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，且可得到良好的酶切效果，故該方法較為簡便。建立的PCR-RFLP方法對臨床分離株進(jìn)行酶切分析，其鑒定的血清型結(jié)果與Hexon基因的測序結(jié)果相一致，表明該方法具有準(zhǔn)確性。

故本試驗基于Hexon基因建立的FAdVs PCR-RFLP分型方法，具有準(zhǔn)確性、簡便性和良好的區(qū)分性，可用于臨床FAdVs的分型診斷。