比卡魯胺聯(lián)合塞來昔布對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP增殖的影響

白曉黎，王 麗，謝秀娟，陳宏偉

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥品調(diào)劑科，洛陽 471003；2.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院，洛陽 471000)

近年來，前列腺癌在全球的發(fā)病率和死亡率逐漸增加[1-2]，其治療面臨極大的挑戰(zhàn)[3-5]。比卡魯胺是一種新型非甾體抗雄激素受體制劑，對(duì)前列腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，已應(yīng)用于臨床[6-7]。塞來昔布是一種COX-2的抑制劑，在治療前列腺炎及前列腺癌中具有較好的應(yīng)用[8-10]。本研究擬培養(yǎng)前列腺癌LNCaP細(xì)胞，給予比卡魯胺、塞來昔布及二者聯(lián)合干預(yù)后，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞生長的抑制情況，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中總前列腺特異抗原(PSA)的濃度，流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡率，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)情況。

1 儀器與材料

1.1儀器 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；電泳儀、電轉(zhuǎn)移裝置(美國BIO-RAD公司)；酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(寧波新芝公司)。

1.2材料 比卡魯胺和塞來昔布(輝瑞制藥公司，批號(hào)分別為H20100309和J20140072)；胰蛋白酶、胎牛血清、F12培養(yǎng)基和Western Blot試劑盒(批號(hào)SC-1004,北京中杉生物公司)；ECL試劑盒(Pierce公司，批號(hào)NCI4106);Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)C1062S)；驢抗兔、Caspase 3和Caspase 8抗體(批號(hào)分別為ab13847和ab25901,Abcam公司)。TBST由實(shí)驗(yàn)室自制；前列腺癌細(xì)胞LNCaP(上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，批號(hào)CRL-1740),培養(yǎng)于含90%的F12培養(yǎng)液、體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 u·mL-1的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2，常規(guī)培養(yǎng)。2 d換液1次，8 d用胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代1次。

2 方法

2.1細(xì)胞MTT測(cè)試 MTT按照3×104個(gè)細(xì)胞·孔-1的規(guī)格接種至96孔板中，在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)。取處于生長對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，分別加入50 μmol·L-1比卡魯胺、40 μmol·L-1塞來昔布以及50 μmol·L-1比卡魯胺聯(lián)合40 μmol·L-1塞來昔布，對(duì)照組不加處理因素。作用于前列腺癌LNCaP細(xì)胞24，48 和72 h。終止培養(yǎng)4 h前加入質(zhì)量濃度為5 g·L-1的MTT 10 μL，4 h后棄上清液，留下MTT結(jié)晶，用DMSO進(jìn)行溶解，在波長為570 nm，參考波長為630 nm處，用Biotek EJ309酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值A(chǔ)，每組重復(fù)3次取平均值，以空白組吸光度值A(chǔ)為0，計(jì)算生長抑制率。細(xì)胞生長抑制率=1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度值A(chǔ)-對(duì)照組吸光度值A(chǔ))×100%。

2.2細(xì)胞凋亡率的測(cè)定 依照2.1項(xiàng)下方法操作，作用于細(xì)胞48 h后，收集所有細(xì)胞，以1 000 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入新鮮配制的PBS緩沖液(pH=7.4)3 mL，沖洗2次，離心5 min，棄上清液，將細(xì)胞重懸于Binding Buffer 200 μL，Annexin V-FITC 10 μL和PI 5 μL中，輕盈混勻，遮光反應(yīng)15 min，加入Binding Buffer 300 μL，1 h內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2.3Western Blot 依照2.1項(xiàng)下方法操作，作用于細(xì)胞48 h后，收集所有細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌，添加富含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強(qiáng)效細(xì)胞裂解液，用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，BCA法進(jìn)行蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，Caspase 3和Caspase 8抗體(均為1∶500)進(jìn)行孵育，4 ℃放置24 h后用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶500)，ECL試劑盒曝光，系統(tǒng)ImageLab軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算與內(nèi)參蛋白β-actin的相對(duì)值。

3 結(jié)果

3.14組不同時(shí)間點(diǎn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長抑制率 對(duì)照組的生長抑制率均為0，各給藥組的生長抑制率結(jié)果見表1。進(jìn)一步對(duì)組間細(xì)胞的生長抑制率進(jìn)行比較，聯(lián)合組顯著優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。

表1 4組不同時(shí)間點(diǎn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的生長抑制率

組別不同時(shí)間(h)細(xì)胞的生長抑制率/%244872對(duì)照組000比卡魯胺組32.91±3.2145.09±3.0453.92±4.12塞來昔布組35.18±2.7947.16±3.3356.12±3.26聯(lián)合組43.76±3.18?#63.11±2.98?#69.97±4.15?#F261.94503.43424.13P0.000.000.00

注：與塞來昔布組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05。

3.24組細(xì)胞培養(yǎng)液中總前列腺特異抗原(PSA)的變化 與對(duì)照組比較，比卡魯胺組、塞來昔布組以及聯(lián)合組的PSA濃度明顯降低，其中聯(lián)合組對(duì)PSA的抑制程度明顯優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見圖1。

3.34組不同時(shí)間點(diǎn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的凋亡率比較 進(jìn)一步對(duì)組間細(xì)胞的凋亡率進(jìn)行比較，聯(lián)合組顯著優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見表2。

3.44組細(xì)胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)情況 與對(duì)照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組和聯(lián)合組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，聯(lián)合組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)水平明顯高于比卡魯胺組和塞來昔布組(P<0.05)。見圖2。

圖1 4組細(xì)胞培養(yǎng)液中總前列腺特異抗原的變化

注：與對(duì)照組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05；與塞來昔布組比較&P<0.05。

Fig.1 Changes of total prostate specific antigen in 4 groups of cell culture fluids

Note：*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs bicalutamide group；&P<0.05 vs celecoxib group.

表2 4組不同時(shí)間點(diǎn)前列腺癌LNCaP細(xì)胞的凋亡率

組別不同時(shí)間(h)細(xì)胞的凋亡率/%244872對(duì)照組1.45±0.113.12±0.212.14±0.13比卡魯胺組22.11±1.3136.19±2.0851.12±3.21塞來昔布組26.19±2.1942.11±3.0256.72±3.82聯(lián)合組33.13±1.28?#56.12±3.16?#66.67±3.25?#F455.07429.61465.78P0.000.000.00

注：與塞來昔布組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05。

圖2 4組細(xì)胞Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)情況

注：與對(duì)照組比較*P<0.05；與比卡魯胺組比較#P<0.05；與塞來昔布組比較&P<0.05。

Fig.2 Expression of Caspase 3 and Caspase 8 proteins in 4 groups of cells

Note：*P<0.05 vs control group；#P<0.05 vs bicalutamide group；&P<0.05 vs celecoxib group.

4 討論

比卡魯胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞LNCaP具有顯著的生長抑制作用[11-12]。研究表明，比卡魯胺聯(lián)合塞來昔布存在協(xié)同作用，可抑制LNCaP細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡；其作用可能通過Caspase 3介導(dǎo)[13]。在體外培養(yǎng)條件下，睪酮對(duì)LNCaP-FCG細(xì)胞的生長依濃度關(guān)系呈雙向作用，比卡魯胺依濃度關(guān)系抑制LNCaP-FCG細(xì)胞的生長[11]。塞來昔布可通過調(diào)控凋亡蛋白的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14-15]。研究表明，塞來昔布作為選擇性COX-2抑制劑可誘導(dǎo)激素非依賴性前列腺癌DU-145細(xì)胞凋亡，并首次對(duì)腫瘤的侵襲能力進(jìn)一步探討，證實(shí)塞來昔布通過降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力從而增加其抗腫瘤的作用[16-17]。研究顯示，對(duì)照組在24，48和72 h的細(xì)胞生長抑制率均為0。與對(duì)照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組和聯(lián)合組在24，48和72 h的生長抑制率明顯較高。進(jìn)一步對(duì)組間細(xì)胞的生長抑制率進(jìn)行比較，聯(lián)合組顯著優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組，這與既往研究報(bào)道較為一致[11，18-19]?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)顯示，與對(duì)照組相比，比卡魯胺組、塞來昔布組以及聯(lián)合組的PSA濃度明顯降低，其中聯(lián)合組對(duì)PSA的抑制程度明顯優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組。PSA作為診斷及治療前列腺癌的敏感性指標(biāo)，在聯(lián)合組中的表達(dá)得到有效的抑制，提示聯(lián)合比卡魯胺與塞來昔布可有效抑制腫瘤細(xì)胞的活性，這與既往研究較為一致[20-21]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組在24，48和72 h的細(xì)胞凋亡率均低于比卡魯胺組、塞來昔布組和聯(lián)合組在24，48和72 h的生長抑制率。進(jìn)一步對(duì)組間細(xì)胞的生長抑制率進(jìn)行比較，聯(lián)合組顯著優(yōu)于比卡魯胺組和塞來昔布組，符合預(yù)期。Western Blot結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，給藥組Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，聯(lián)合組Caspase 3和Caspase 8蛋白表達(dá)水平明顯高于比卡魯胺組和塞來昔布組。提示比卡魯胺聯(lián)合塞來昔布抑制前列腺癌細(xì)胞的生長抑制率以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Caspase 3和Caspase 8蛋白的表達(dá)有關(guān)，這與本實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果較為一致。

綜上所述，比卡魯胺聯(lián)合塞來昔布能有效抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP的增殖，其機(jī)制可能與促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Caspase 3和Caspase 8進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡有關(guān)，有望為臨床治療前列腺癌帶來新思路。