黃精配方顆粒的質(zhì)量標準研究

劉恩俊，肖會敏，康曉剛，曹愛蘭，張 俏，王四旺，謝艷華*

(1.空軍軍醫(yī)大學(xué)中藥和天然藥物教研室，西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，西安 710032；3.陜西中藥研究所，咸陽 712000)

黃精屬多年生草本植物的干燥根莖，具有補脾潤肺、益氣養(yǎng)陰之功效[1]。黃精的主要成分有黃精多糖、甾體皂苷、多種氨基酸、酚類和5-羥甲基糠醛(5-HMF)等[2-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃精有抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖血脂和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[4-7]；其主要成分黃精多糖、總酚和5-羥甲基糠醛具有調(diào)節(jié)血糖血脂、抗腫瘤和增強免疫力等功效[8-13]。黃精配方顆粒是以黃精飲片為原料，經(jīng)水煎煮提取、濃縮、干燥和制粒制成的顆粒，供臨床配方用，具有攜帶方便、保存方便和質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點[14-16]。目前尚無黃精配方顆粒質(zhì)量標準的研究報道，為了保證該配方顆粒制劑的療效，現(xiàn)對其進行質(zhì)量控制研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(Prominen UFLC，LC/Labsoluion色譜工作站)，購自日本島津公司；UA2600型可見光-紫外分光光度計，購自中國天美科學(xué)儀器有限公司；AcculabVIC-412型十萬分之一電子分析天平，購自德國賽多利斯集團；5417R型高速冷凍離心機，購自德國艾本德生命科技集團公司；SK2510LHC型雙頻加熱型超聲波清洗器，購自上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2試藥 乙腈和甲醇均為色譜純，購自美國Honeywell公司；水為超純水，Millipore純水儀(美國Millipore公司)制備；黃精對照藥材(批號12141-200401)，無水葡萄糖對照品(批號110833-200904)，5-羥甲基糠醛(批號111626-201610，質(zhì)量分數(shù)為99.2%)，沒食子酸(批號111831-201605，質(zhì)量分數(shù)為90.8%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；黃精配方顆粒及其對應(yīng)浸膏粉[批號分別為：20160801(S1)，20160802(S2)，20160803(S3)，20160804(S4)，20160805(S5)，20160806(S6)，20160807(S7)，20160808(S8)，20160809(S9)，20160810(S10)，20160811(S11)和20160812(S12)，均由陜西醫(yī)藥控股集團有限責任公司提供]；硅膠G板，購自青島海洋化工廠；蒽酮(批號20171201)和乙醇(批號20180330)均為分析純，購自天津市富宇試劑有限公司；濃硫酸(批號20171130)，分析純，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1黃精配方顆粒的TLC鑒別 取樣品2 g，加入體積分數(shù)為70%的乙醇50 mL，加熱回流1 h，抽濾，濾液蒸干，殘渣中加入10 mL水，溶解，加正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇，蒸干溶劑，加入1 mL甲醇使殘渣溶解，作為供試品溶液[17]；另精密稱取黃精對照藥材1 g，按照上述方法制備黃精對照藥材溶液。按照文獻方法進行實驗[18]，精密吸取供試品溶液和對照藥材溶液各10 μL，在同一硅膠G薄層板上依次點樣，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.1)為展開劑，展開，取出，噴以質(zhì)量濃度為50 g·L-1的香草醛硫酸溶液，置于105 ℃的烘箱中加熱，直至斑點顯色清晰，將薄層板置于日光下檢視，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照藥材色譜的相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖1。

圖1 TLC圖

1～3.對照藥材；4～15.樣品(批號：20160801，20160802，20160803，20160804，20160805，20160806，20160807，20160808，20160809，20160810，20160811，20160812)。

Fig.1 TLC chromatogram

1-3.reference substance；4-15.sample(batch number：20160801，20160802，20160803，20160804，20160805，20160806，20160807，20160808，20160809，20160810，20160811，20160812).

2.2黃精多糖的含量測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取在105 ℃干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖對照品33.28 mg，置于100 mL量瓶中，加水定容并搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.332 8 g·L-1的對照品溶液[17]。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取在60 ℃干燥至恒質(zhì)量的黃精配方顆粒浸膏粉(批號20160808) 0.25 g，置于50 mL離心管中，加入10 mL水，超聲15 min使溶解，加入40 mL無水乙醇，快加慢攪，在4 ℃冰箱中靜置12 h，以6 000 r·min-1在4 ℃低溫下離心15 min，棄上清液，氮氣吹干沉淀，加水溶解，移至250 mL量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.3空白對照溶液的制備 取水2 mL，置于10 mL具塞干燥試管中，在冰水浴中緩慢滴加質(zhì)量濃度為2 g·L-1的蒽酮-硫酸溶液，邊加邊混勻至刻度線，待溶液放冷后，立即置于沸水浴中保溫10 min，取出，在冰水浴中冷卻10 min，取出，待溶液冷卻至室溫，即得。

2.2.4葡萄糖的標準曲線 精密吸取2.2.1項下制備的對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL，分別置于10 mL試管中，加水定容至2 mL刻度，振蕩搖勻，置于冰水浴中，緩慢滴加質(zhì)量濃度為2 g·L-1的蒽酮-硫酸溶液至10 mL刻度，邊加邊混勻，待溶液放冷后，立即置于沸水浴中保溫10 min，取出，在冰水浴中冷卻10 min，取出，待溶液冷卻至室溫，按照文獻方法實驗[18]，以2.2.3項下制備的溶液為空白對照，以吸光度值為縱坐標(y)、無水葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，在582 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)并繪制標準曲線，得標準曲線y1=4.034x1+0.028，r1=0.999 3(n=6)。結(jié)果表明，無水葡萄糖質(zhì)量濃度在0.033 28～0.199 68 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5精密度實驗 精密吸取2.2.1項下制備的對照品溶液0.2 mL，置于10 mL具塞干燥試管中，按照2.2.4項下方法測定吸光度值A(chǔ)，重復(fù)5次。結(jié)果RSD值為0.43%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性實驗 精密吸取黃精配方顆粒浸膏粉(批號20160808)0.25 g，置于10 mL試管中，依照2.2.4項下方法，在室溫下于第0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0和12.0 h測定其吸光度值A(chǔ)，結(jié)果RSD值為0.71%，表明實驗穩(wěn)定性良好。

2.2.7重復(fù)性實驗 精密吸取黃精配方顆粒浸膏粉(批號20160808)0.25 g，6份，按照2.2.4項下方法測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果RSD值為2.65%，表明實驗重復(fù)性良好。

2.2.8加樣回收率實驗 精密稱取黃精配方顆粒浸膏粉0.25 g(批號20160808)9份，各組分別精密加入已知含量的葡萄糖對照品溶液，按照表1數(shù)據(jù)添加，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.2.4項下方法測定其吸光度值A(chǔ)，結(jié)果見表1。

表1 黃精多糖回收率實驗結(jié)果

Tab.1 The results of recovery rate test ofPolygonatumpolysaccharide

樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.250 912.089.6321.6099.7198.312.180.253 112.189.6321.99100.860.252 412.159.6321.4398.420.251 112.0812.0423.6097.860.250 612.0612.0423.0395.560.252 312.1512.0422.9695.260.254 112.2314.4525.7596.520.250 412.0614.4526.65100.530.252 512.1514.4526.63100.12

2.2.9樣品的含量測定 取12批不同產(chǎn)地的供試品溶液各1 mL，分別置于10 mL試管中，按照2.2.4項下方法測定吸光度值A(chǔ)，計算黃精配方顆粒中黃精多糖的含量，結(jié)果見表1。

2.3總酚的含量測定

2.3.1沒食子酸對照品溶液的制備 精確稱取已烘干至恒質(zhì)量的沒食子酸對照品13.24 mg，置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.262 8 g·L-1的沒食子酸對照品溶液[19]。

2.3.2供試品溶液的制備 取黃精配方顆粒3袋(批號20180801)，研細，混勻，精確稱取2 g，置于試管中，加入20 mL水，在250 W、40 kHz條件下超聲30 min，過濾殘渣，收集濾液，提取3 次，用旋蒸儀蒸干，加水定容至1 mL，過濾，即得。

2.3.3沒食子酸的標準曲線 分別精密吸取2.3.1項下制備的對照品溶液0，20，40，60，80，100，120，140，160和200 μL，分別置于5 mL 棕色量瓶中，加入3.2 mL水、200 μL福林酚顯色劑，充分振蕩混勻，靜置6～8 min，再加入質(zhì)量濃度為150 g·L-1的碳酸鈉溶液500 μL。充分混勻，避光放置，室溫下反應(yīng)2 h。在765 nm波長處檢測其吸光度值A(chǔ)。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(y)、吸光度值為縱坐標(x)，繪制標準曲線。實驗結(jié)果表明，沒食子酸的標準曲線為y2=12.94x2+0.144，r2=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.005 2～0.052 0 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4精密度實驗 精密吸取2.3.1項下制備的對照品溶液40 μL，置于5 mL 棕色量瓶中，按照2.3.3項下方法測定吸光度值，重復(fù)5次。結(jié)果RSD值為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.3.5穩(wěn)定性實驗 精密吸取2.3.2項下制備的供試品溶液(批號20160801)40 μL，置于棕色量瓶中，按照2.3.3項下方法測定吸光度值，在室溫下2 h內(nèi)每隔一定時間測定其吸光度值，結(jié)果RSD值為0.88%，表明實驗穩(wěn)定性良好。

2.3.6重復(fù)性實驗 精密吸取2.3.2項下制備的供試品溶液(批號20160801)40 μL，6份，按照2.3.3項下方法測定吸光度值A(chǔ)。結(jié)果RSD值為1.25%，表明實驗重復(fù)性良好。

2.3.7加樣回收率實驗 精密吸取2.3.2項下制備的供試品溶液0.1 mL(批號20160801)，9份，各組分別精密加入已知質(zhì)量濃度的沒食子酸對照品溶液0.1 mL，按照2.3.3項下方法顯色后，以不含沒食子酸的溶液作為空白對照，于765 nm波長處測定吸光度值A(chǔ)，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 總酚回收率實驗結(jié)果

Tab.2 The results of recovery rate test of total phenolic acid

樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%1.07512.949.5222.4099.7398.960.681.08713.099.5222.5199.551.03412.459.5221.9099.681.05312.6811.9024.2398.571.02312.3211.9023.9398.801.06512.8211.9024.1397.611.08512.0614.2826.1199.121.07612.9614.2826.8798.641.03312.4414.2826.4598.98

2.3.8樣品中總酚含量的測定 精確吸取2.3.2項下制備的供試品溶液40 μL，按照2.3.3項下方法測定并計算黃精配方顆粒中的總酚含量，結(jié)果見表4。

2.45-羥甲基糠醛的含量測定

2.4.1色譜條件 色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95)；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35 ℃；檢測波長：274 nm；進樣量：10 μL。色譜圖見圖2。

2.4.2對照品溶液的制備 精密稱取5-羥甲基糠醛10.08 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為2.00 g·L-1的對照品溶液。

2.4.3供試品溶液的制備 取本品3袋(批號20160808)，研細，混勻，精密稱取10 g，置于具塞錐形瓶中，加水50 mL，稱定質(zhì)量，在250 kW、40 kHz條件下超聲處理30 min，放冷至室溫，補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關(guān)系 分別精密量取2.4.2項下制備的對照品溶液0.02，0.10，0.20，0.50，1.00和2.00 mL，分別置于2 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，測定含量。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(x)、峰面積值為縱坐標(y)，得線性方程y3=15 468 610x3-663 735，r3=0.999 1 (n=6)。結(jié)果表明，5-羥甲基糖醛質(zhì)量濃度在0.020～2.000 g·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5精密度實驗 精密吸取2.4.3項下制備的供試品溶液適量(批號20160808)，重復(fù)進樣5次，測得5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值為1.00%，表明該方法精密度良好。

2.4.6重復(fù)性實驗 精密稱取樣品(批號20160808)6份，分別按照2.4.3項下方法制備的供試品溶液，按照2.4.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，5-羥甲基糠醛的平均含量為0.824 mg·g-1，RSD值為1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖2 HPLC圖

A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.空白對照溶液；1.5-羥甲基糠醛。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.sample solution；B.reference substance；C.blank solution；1.5-HMF.

2.4.7穩(wěn)定性實驗 精密吸取2.4.3項下制備的供試品溶液適量(批號20160808)，分別在0，2，4，8，12和24 h進樣。結(jié)果顯示，5-羥甲基糠醛峰面積的RSD值為0.82%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收率實驗 精密量取黃精配方顆粒(批號20160808，其中5-羥甲基糠醛的含量為0.824 0 mg·g-1)1.0 g，按照表3分別添加對照品溶液(精密稱取5-羥甲基糠醛適量，制成質(zhì)量濃度為8.10 g·L-1的水溶液0.80，1.00和1.20 mL，再加水定容至刻度，按照2.4.3項下方法制備9份供試品溶液，按照2.4.1項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表3，表明該方法加樣回收率良好。

2.4.9含量測定 精密稱取12批樣品，分別按照2.4.3項下方法制備供試品溶液，按照2.4.1項下色譜條件測定5-羥甲基糠醛的含量。各批配方顆粒樣品中5-羥甲基糠醛的含量見表4。

表3 5-羥甲基糠醛的回收率測定結(jié)果

Tab.3 The results of recovery rate of 5-HMF

樣品量/g原有量/mg加入量/mg測定量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%9.956 88.204 46.4814.5197.3197.161.079.971 58.216 56.4814.4496.049.965 48.211 46.4814.4998.629.897 68.155 68.1016.0797.719.884 58.144 88.1016.1298.469.921 18.174 08.1015.8297.259.873 58.135 79.7217.3397.119.753 88.037 19.7217.3295.509.995 68.236 49.7217.6196.44

表4 12批黃精配方顆粒中黃精多糖、總酚和5-羥甲基糠醛含量的測定結(jié)果

Tab.4 Determination ofPolygonatumpolysaccharide，total phenolic acids and 5-HMF in 12 batches ofRhizomaPolygonatumDispensing Granules

批號(產(chǎn)地)黃精多糖/mg·g-1總酚/mg·g-15-羥甲基糠醛/mg·g-120160801(陜西宜君-1)25.3412.040.701 120160802(陜西宜君-2)23.6411.900.790 620160803(陜西宜君-3)44.9411.970.858 220160804(陜西宜君-4)41.4711.310.635 120160805(陜西宜君-5)29.9815.280.891 620160806(陜西宜君-6)35.5215.820.622 920160807(陜西合陽)30.4913.280.573 620160808(陜西柞水)48.1416.340.824 020160809(陜西眉縣)42.5918.950.648 020160810(陜西留壩)34.6516.530.790 620160811(陜西勉縣)22.5115.300.800 520160812(陜西安康)37.4813.530.733 7平均含量/mg·g-134.7314.350.739 2RSD/%24.5616.5213.85

3 討論

3.1TLC鑒別 本實驗對12批不同產(chǎn)地的黃精配方顆粒進行TLC鑒別，在展開劑的選擇上參考文獻[17]選擇石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸為展開劑，展開劑的比例考察了石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶3∶0.1)和石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶0.1)不同比例的展開劑，最終發(fā)現(xiàn)在石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶0.1)，展開后噴以質(zhì)量濃度為50 g·L-1的條件下香草醛硫酸溶液分離效果最好。結(jié)果顯示，TLC鑒別圖譜分離度好、專屬性強、重復(fù)性好且操作方法簡單，可列入藥品質(zhì)量標準。

3.2總酚含量的質(zhì)量標準 總酚的線性范圍為0.005 2～0.052 0 g·L-1，對應(yīng)的吸光度值為0.208 4～0.815 2，符合紫外分光光度計的0.1～1.0的范圍，所測的總酚吸光度值均在線性范圍內(nèi)。12批不同產(chǎn)地的黃精配方顆粒中總酚的含量存在顯著差異，其中含量最高的為陜西眉縣，為18.95 mg·g-1；含量最低的為陜西宜君-4，為11.31 mg·g-1，但差異較小，因此可將總酚含量不得低于11.00 mg·g-1列入質(zhì)量標準。

3.3黃精多糖含量的質(zhì)量標準 本研究選擇無水葡萄糖作為對照品，因為蒽酮-硫酸法的原理為多糖與濃硫酸反應(yīng)脫水生成糖醛，糖醛與蒽酮反應(yīng)生成藍綠色沉淀，該沉淀在582 nm波長處有最大吸光度值，而葡萄糖也可發(fā)生上述反應(yīng)。目前多糖的含量測定多以無水葡萄糖計，故選用無水葡萄糖作為對照品。葡萄糖標準曲線的線性范圍為0.033 28～0.199 68 g·L-1，對應(yīng)的吸光度值為0.162 2～0.833 5，符合紫外分光光度計的0.1～1.0的范圍，所測的多糖吸光度值均在線性范圍內(nèi)。

研究發(fā)現(xiàn)，由于配方顆粒中加入糊精等輔料，在使用蒽酮-硫酸法測定多糖時糊精會對檢測結(jié)果造成干擾，使得測定量結(jié)果偏大，因此為了排除糊精對測定量結(jié)果的干擾，本次實驗使用黃精配方顆粒浸膏粉來制備供試品溶液。質(zhì)量濃度為2 g·L-1的蒽酮-硫酸溶液，臨用現(xiàn)配且需要避光保存。另外，反應(yīng)時間、水浴溫度需按照實驗標準執(zhí)行[17]。文獻[20-22]報道，黃精浸膏的多糖提取采用醇沉法進行提取，所用乙醇為無水乙醇，沉淀1次，該法穩(wěn)定且重復(fù)性好，加樣回收率高，RSD值均小于3%，可用來測定黃精多糖的含量。結(jié)果顯示，12批不同產(chǎn)地的黃精配方顆粒中黃精多糖最高和最低含量分別為48.14 和22.51 mg·g-1，RSD值為24.56%，說明不同產(chǎn)地黃精多糖含量具有明顯差異，但黃精多糖為該配方顆粒的主要成分，含量較高，因此將黃精多糖含量不得低于24.00 mg·g-1列入質(zhì)量標準。

3.45-羥甲基糠醛含量的質(zhì)量標準 本品為水提物，成分復(fù)雜，主要成分為氨基酸、多糖和黃酮類等成分。HPLC法檢測該產(chǎn)品中的多糖和氨基酸需要進行衍生化，操作復(fù)雜，干擾因素較多。因此，選擇5-羥甲基糠醛作為本品檢測的單體成分[23]，經(jīng)過對色譜條件進行優(yōu)化，即色譜條件為：色譜柱為Intersil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.85 mL·L-1磷酸水溶液(5∶95)；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為274 nm；進樣量為10 μL。經(jīng)過對12批不同產(chǎn)地配方顆粒的分析，結(jié)果顯示，5-羥甲基糖醛最高和最低含量分別為0.891 6和0.573 6 mg·g-1，RSD值為13.85%，說明不同產(chǎn)地黃精配方顆粒中5-羥甲基糠醛的含量具有明顯差異，但5-羥甲基糠醛為該配方顆粒的主要成分，含量較高，因此，將5-羥甲基糠醛含量不得低于0.500 0 mg·g-1列入質(zhì)量標準。

綜上所述，建立的標準穩(wěn)定性與重復(fù)性良好，其測定方法簡單易行，可以很好地控制黃精配方顆粒的質(zhì)量。