熒光法快速測定水中糞大腸菌群

由希華，徐 標(biāo)，李恒慶，宗雪梅

山東省環(huán)境監(jiān)測中心站，山東 濟(jì)南 250101

糞大腸菌群，是指一群能在(44.5±0.5)℃ 溫度下生長，發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，國外又稱耐熱大腸菌群。主要來源于人畜糞便，可導(dǎo)致腸道傳染病傳播[1]。水源水一旦被糞便污染，就存在腸道病原菌污染引起腸道傳染病甚至流行病的可能。因此，糞大腸菌群的檢測可準(zhǔn)確及時地監(jiān)控水源水受糞便污染的狀況，為相關(guān)部門有效預(yù)報和控制流行疾病的發(fā)生與傳播提供重要依據(jù)。

目前，國內(nèi)外糞大腸菌群的檢測方法可分為多管發(fā)酵法、快速紙片法、濾膜法、酶底物法、熒光原位雜交(FISH) 技術(shù)、PCR 技術(shù)等[1-3]。國內(nèi)糞大腸菌群監(jiān)測方法主要有濾膜法、多管發(fā)酵法，并且這2種方法均屬于國標(biāo)方法[4]，被國內(nèi)環(huán)境監(jiān)測部門廣泛采用。這2種方法分析成本低，結(jié)果較準(zhǔn)確，但是操作繁瑣，需專業(yè)人員嚴(yán)格控制無菌條件，操作時間長(至少需要48 h)，并需要驗證試驗，不能快速對水的衛(wèi)生狀況作出評價[3]，不適合應(yīng)急現(xiàn)場監(jiān)測。因此，采用更為快速、簡便、精確的監(jiān)測方法顯得尤為重要。熒光法可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，無需專業(yè)技術(shù)人員和嚴(yán)格無菌條件，無需驗證試驗。熒光法操作簡單，一般人員經(jīng)過簡單培訓(xùn)即可在現(xiàn)場完成操作，并且測定范圍廣，無需稀釋，測定范圍可達(dá)108MPN/100 mL，消除了人為帶入的誤差。全自動微生物監(jiān)測儀可獨(dú)立自動完成培養(yǎng)、測試、結(jié)果判讀、發(fā)送報告等工作，故不受場地限制，可直接應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)測。監(jiān)測時間為動態(tài)時間，與待測樣本中目標(biāo)細(xì)菌的濃度有關(guān)，濃度越高，檢測時間越短，最快可2 h內(nèi)給出陽性測試報告，最長需要18 h。并可在第一時間將測試報告發(fā)送到指定郵箱，更適合應(yīng)用于應(yīng)急現(xiàn)場監(jiān)測，做到早期預(yù)警，防止進(jìn)一步危害的發(fā)生。

2010年，加拿大皇后大學(xué)研究人員和加拿大水質(zhì)專家組成科研團(tuán)隊，提出使用聚合物光學(xué)傳感器檢測同類型微生物熒光指標(biāo)的方法。該方法目前已經(jīng)在全球十余個國家和地區(qū)得到廣泛應(yīng)用，并獲得多個權(quán)威部門的認(rèn)證，這些部門包括中國環(huán)境監(jiān)測總站、中國疾病預(yù)防控制中心、美國環(huán)保署、AOAC協(xié)會、新西蘭衛(wèi)生部、菲律賓衛(wèi)生部等。

1 實驗部分

1.1 儀器設(shè)備及試劑

實驗所用儀器和設(shè)備主要有微生物快速測定儀、培養(yǎng)箱、冰箱、高壓蒸汽滅菌器、天平、采樣瓶等。

實驗試劑包括：糞大腸檢測試劑套筒(以下簡稱FCA套筒)、乳糖蛋白胨培養(yǎng)液、EC培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、硫代硫酸鈉溶液、無菌水等。

1.2 反應(yīng)原理

將一定量的水樣與培養(yǎng)基混合均勻放置于44.5 ℃溫度下培養(yǎng)，糞大腸菌群在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，并分解熒光底物釋放出熒光產(chǎn)物(疏水)。熒光產(chǎn)物逃離水樣聚合至光學(xué)檢測區(qū)，通過光度計測定，依據(jù)熒光強(qiáng)度與水中糞大腸菌群數(shù)成一定關(guān)系的原理，建立數(shù)學(xué)模型，從而得出糞大腸菌群的濃度。

1.3 實驗方法

打開電源開關(guān)，設(shè)置添加樣品，錄入樣品編號，選擇TECTA-FCA-FC選項，點擊“ADD”，設(shè)置完成。將注入100 mL水樣的FCA套筒放入指定檢測池。關(guān)閉上蓋，儀器開始自動檢測。當(dāng)儀器檢測到糞大腸菌群，自動檢測停止，并報告檢測數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 準(zhǔn)確度的測定

微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，按其統(tǒng)計分析要求，檢測所得結(jié)果全部經(jīng)對數(shù)(以10為底)轉(zhuǎn)換后，再進(jìn)行精密度與準(zhǔn)確度的統(tǒng)計分析。

采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)美國IDEXX糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)菌株(NCTC 9001)驗證方法準(zhǔn)確性，標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度為653MPN/100 mL(65～1 350MPN/100 mL)。

將無菌水加入FCA套筒中，并定容至100 mL。將標(biāo)準(zhǔn)菌株加入套筒中，蓋緊上蓋，搖勻。放入微生物檢測儀中檢測。

在6家實驗室對標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測定，每家實驗室平行測定6次，測試結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)菌株測試結(jié)果Table 1 Standard strain testing results MPN/L

對實驗室數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計分析，計算實驗室內(nèi)相對誤差，以計算熒光法的準(zhǔn)確度。結(jié)果表明：6家實驗室平行測定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度(65～1 350MPN/100 mL)誤差范圍內(nèi)，實驗室內(nèi)相對誤差為-2.75%～1.71%，準(zhǔn)確度較高。

2.2 精密度測定

實驗室精密度的研究需要采集高(4.6×107MPN/L)、中(4.6×105MPN/L)、低(4.6×103MPN/L)3個不同濃度水平實際水樣進(jìn)行測試，在6家實驗室中每家實驗室平行測定6次。

將待測水樣加入FCA套筒中，并定容至100 mL。蓋緊上蓋，搖勻，放入微生物檢測儀中檢測，測試結(jié)果見表2～表7。

表2 1號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 2 No.1 laboratory regular water sample precision test data

注：i為實驗次數(shù)，S和RSD為原始數(shù)據(jù)以10為底，對數(shù)轉(zhuǎn)化后計算所得，下同。

表3 2號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 3 No.2 laboratory regular water sample precision test data

表4 3號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 4 No.3 laboratory regular water sample precision test data

表5 4號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 5 No.4 laboratory regular water sample precision test data

表6 5號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 6 No.5 laboratory regular water sample precision test data

表7 6號實驗室實際水樣精密度測試數(shù)據(jù)Table 7 No.6 laboratory regular water sample precision test data

對實驗室的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總統(tǒng)計分析，計算實驗室內(nèi)精密度，以實驗室內(nèi)和實驗室間相對偏差表示[5]。監(jiān)測結(jié)果表明：6家實驗室內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為1.30%～3.93%、1.94%～4.72%、1.88%～4.54%，實驗室間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.14%、1.59%、1.72%，精密度較高。

2.3 熒光法與多管發(fā)酵法相關(guān)性實驗

選擇不同的地表水、廢水樣品進(jìn)行熒光法與多管發(fā)酵法比對測試[6-9]，討論方法適用性。實驗中采用38份地表水及污水水樣進(jìn)行糞大腸菌群的監(jiān)測，多管發(fā)酵法所用培養(yǎng)基、試劑和測定方法參照《水質(zhì) 糞大腸菌群的測定 多管發(fā)酵法和濾膜法(試行)》[4]的相關(guān)要求，熒光法操作步驟同上，熒光法和多管發(fā)酵法測糞大腸菌群的線性回歸分析見圖1。相關(guān)系數(shù)(r)為0.984 4，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)為0.984，回歸系數(shù)(B)為1.077，表明熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相關(guān)關(guān)系。

圖1 2種方法測定結(jié)果變化趨勢Fig.1 The tendency chart of the ammonium determined by the methods

對2種方法檢測的糞大腸菌群結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗[10-11]，用來檢驗2種方法測定結(jié)果的差異性，統(tǒng)計結(jié)果表明，2種方法無顯著差異。結(jié)果見表8。

表8 熒光法和多管發(fā)酵法t檢驗結(jié)果Table 8 Results of t test by fluorescence and multi-tube method

3 結(jié)論

精密度和準(zhǔn)確度實驗表明，熒光法測定糞大腸菌群具有較高精密度和準(zhǔn)確度；熒光法和多管發(fā)酵法相關(guān)性實驗表明，2種方法在測定結(jié)果一致性、相關(guān)性等方面沒有顯著差異，初步認(rèn)為熒光法可應(yīng)用于地表水和廢水中糞大腸菌群的檢測。

熒光法相比于傳統(tǒng)多管發(fā)酵法具有明顯優(yōu)點，操作簡單，監(jiān)測時間短，可在現(xiàn)場直接監(jiān)測，測定范圍廣，可同時測定多個樣品，能快速判斷水樣的微生物污染狀況，尤其適用于應(yīng)急現(xiàn)場監(jiān)測，可應(yīng)用于地表水、廢水中的糞大腸菌群檢測。