山奈酚激活mTOR通路對心肌細胞缺氧損傷的保護作用①

王 成 郭長磊 李 霞 劉 振 韓明磊 侯永蘭 楊秀麗

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院心血管內(nèi)一科，新鄉(xiāng)453000)

缺血性心臟病經(jīng)常表現(xiàn)為急性心肌梗死，是世界范圍內(nèi)導致死亡和心力衰竭的主要原因[1]。未能滿足心臟的氧氣需求通常是缺血性心臟病的直接原因之一。抗缺血療法，通過增加心肌供氧和/或降低心肌耗氧量，使用抗心絞痛藥物來緩解或預防急性缺血發(fā)作，已被證明是缺血性心臟病的一個非常重要的治療手段。因此，保護心肌細胞免受低氧損傷是降低缺血性心臟病風險的合理治療策略之一[2]。氯化鈷(CoCl2)是著名的組織缺氧模擬劑[3]。據(jù)報道，CoCl2能夠在許多方面模擬低氧反應(yīng)，例如，減少細胞生存能力，線粒體膜電位消散，激活caspase-3和誘導細胞凋亡[3]。類黃酮是一種天然的多酚類化合物，具有廣泛的生物活性。山奈酚(Kaempferol,KPF，3,4,5,7-四羥黃酮)是一種植物雌激素，結(jié)構(gòu)如圖1所示，是最常見的膳食類黃酮類化合物之一，常見于茶、花椰菜、柚子和其他植物[4]。山奈酚具有抗氧化、抗凋亡和抗炎性質(zhì)[5-7]。已有研究表明山奈酚可保護心臟對抗阿霉素誘導的心臟毒性，說明山奈酚的心臟保護作用[8]。本文旨在研究山奈酚對缺氧H9C2細胞的保護作用和機制。

1 材料與方法

1.1材料 山奈酚購自美國Sigma-Aldrich(96353,Sigma)。化學式：C15H10O6，分子量：286.24，純度>99%，用DMSO配制成1 mol/L的母液，使用時稀釋至所需濃度。DMEM培養(yǎng)基、FBS和胰蛋白酶購自美國Gibco 公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學公司。丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：A003-1)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(貨號：A001-1)購自中國南京建城生物工程研究所。BCA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所?？笲eclin 1、 P62、 LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、mTOR和Unc51-like kinase 1(ULK1)抗體購自美國Abcam公司。Hoechst染色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與處理 人H9C2細胞來源于中科院上海生物研究所細胞庫。H9C2細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清(FBS)和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，并放置在37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基每2～3 d更換1次，當需要收集細胞時，用 0.25% 胰蛋白酶消化。后續(xù)實驗選擇 5、10、 20 μmol/L的山奈酚進行處理。Hoechst染色。

圖1 山奈酚化學結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of Kaempferol

1.2.2缺氧細胞模型建立和分組 H9C2細胞接種在96孔板，接種密度為(1.5～1.8)×104/孔或者接種在6孔板，接種密度為(8～10)×105/孔，然后用1 200 μmol/L CoCl2加入培養(yǎng)基處理細胞24 h 誘導細胞缺氧模型。H9C2細胞分為5組：對照組(H9C2)，模型組(Hypoxia)：1 200 μmol/L CoCl2處理對照組(H9C2)細胞24 h，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L， KPF 20 μmol/L)：分別用5、10、 20 μmol/L KPF+1 200 μmol/L CoCl2處理細胞24 h。

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖 各組細胞處理后，連續(xù)培養(yǎng)4 d，每天檢測各組待測細胞的數(shù)量，制成增殖倍數(shù)曲線。首先用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液將待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，然后在37℃培養(yǎng)1～4 h，最后在450 nm處檢測吸光值，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.4氧化應(yīng)激標記物檢測 根據(jù)試劑盒說明書，用MDA測定試劑盒測定細胞裂解液中MDA的含量；用SOD測定試劑盒測定細胞裂解液中SOD的含量。液氮研磨腦組織，按說明書進行操作。MDA 在532 nm 處測OD值，SOD在550 nm處測OD值。

1.2.5細胞凋亡檢測 根據(jù)Hoechst染色試劑盒說明書進行操作：消化收集細胞，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 ml 固定液，固定10 min或更長時間(可4℃過夜)；去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液；加入0.5 ml Hoechst 33258染色液，染色5 min；去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液；滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核。

1.2.6Western blot 首先將各組待測細胞用PBS將清洗3次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)含量；提取等量的蛋白質(zhì)樣品(20 mg)，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發(fā)光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復3個獨立的實驗。

1.3統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗，分析比較處理組與對照組之間增殖倍數(shù)、凋亡率以及蛋白表達的差異。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1山奈酚促進缺氧心肌細胞增殖 連續(xù)培養(yǎng)各組(對照組和處理組)H9C2細胞4 d檢測細胞增殖倍數(shù)。如圖2所示，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)細胞增殖倍數(shù)明顯減少(P<0.01)；與模型組(Hypoxia)相比，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)增殖倍數(shù)依次提高。山奈酚濃度越高，缺氧心肌細胞增殖倍數(shù)越高(P<0.01)；處理時間越長，增殖能力越強。說明山奈酚以劑量依賴和時間依賴的方式促進缺氧H9C2細胞的增殖能力。

2.2山奈酚抑制缺氧心肌細胞凋亡 為了檢測山奈酚對缺氧H9C2細胞凋亡的影響，本研究采用Hoechst染色檢測細胞凋亡情況。如圖3A所示，致密濃染藍色光點的斑點即為凋亡細胞細胞核，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)明顯促進H9C2細胞凋亡(P<0.01)；與模型組相比(Hypoxia)，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)細胞凋亡率依次降低(圖3B，P<0.01)。如圖3C所示，凋亡蛋白caspase-3和caspase-9表達水平隨KPF濃度升高而降低。說明山奈酚以劑量依賴的方式抑制缺氧H9C2細胞凋亡。

圖2 山奈酚促進缺氧H9C2細胞增殖Fig.2 KPF promoted proliferation of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖3 山奈酚抑制缺氧H9C2細胞凋亡

Fig.3 KPF inhibited apoptosis of hypoxic H9C2 cells

Note: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

2.3山奈酚降低缺氧心肌細胞ROS水平 如圖4所示，與對照組(H9C2)相比，模型組(Hypoxia)SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增加(P<0.01)；與模型組相比(Hypoxia)，處理組(KPF 5 μmol/L，KPF 10 μmol/L，KPF 20 μmol/L)血清中SOD活性顯著升高(P<0.01)，MDA水平顯著下降(P<0.01)。證明山奈酚能增加缺氧心肌細胞SOD活性并降低脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物MDA含量。

圖4 山奈酚降低缺氧H9C2細胞ROS水平Fig.4 KPF reduced ROS level of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖5 山奈酚抑制缺氧H9C2細胞自噬Fig.5 KPF inhibited autophagy of hypoxic H9C2 cellsNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

圖6 山奈酚激活mTOR信號通路Fig.6 KPF activated mTOR pathwayNote: **.P<0.01,vs H9C2 group；##.P<0.01,vs Hypoxia group.

2.4山奈酚抑制缺氧心肌細胞自噬 檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1，p62和LC3的表達，結(jié)果如圖5所示。CoCl2明顯促進Beclin 1、LC3-Ⅱ表達，抑制p62表達；山奈酚呈劑量依賴顯著上調(diào)P62蛋白水平，下調(diào)Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平(圖5A)(P<0.01)。P62與自噬呈負相關(guān)，而Beclin 1和LC3-Ⅱ是自噬體形成的關(guān)鍵蛋白，暗示山奈酚抑制自噬通量。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(圖5B)，說明LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)換為LC3-Ⅱ，同樣暗示證明山奈酚抑制自噬通量。

2.5山奈酚激活mTOR信號通路 為了山奈酚抑制自噬的潛在機制，本文檢測缺氧相關(guān)通路ULK1和自噬通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表達情況，如圖6所示，山奈酚明顯上調(diào)mTOR蛋白的表達，下調(diào)ULK1蛋白表達，且呈劑量依賴的特點。

3 討論

缺血性心臟病已成為世界范圍內(nèi)的主要死亡原因，每年造成超過700萬人死亡。在缺血性心臟病中，冠狀動脈血管的堵塞會導致不可逆的細胞損傷甚至死亡。缺血損傷可降低心肌ATP含量，導致能量應(yīng)激和活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生[9]。缺血使心肌細胞缺氧，導致嚴重或不可逆的心臟損傷[10]。大量的證據(jù)表明，來源于線粒體的過量ROS與心血管疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，如動脈粥樣硬化、心肌梗死和心力衰竭[9]。目前證據(jù)表明，CoCl2是一種非常重要的低氧誘導因子[11]。本文研究顯示，CoCl2處理H9C2細胞24 h細胞增殖倍數(shù)明顯降低、凋亡率明顯提高、SOD水平降低和MDA水平增高說明ROS水平也增加，最終導致心肌細胞死亡，驗證了CoCl2誘導低氧損傷的潛力。

研究表明，植物源性多酚類非甾體化合物，包括類黃酮和非黃酮類化合物在保護心臟特征中具有有效的抗氧化性。這些性質(zhì)部分與羥基的取代有關(guān)，這可能直接導致自由基的消失[8]。誘導的心肌細胞死亡的主要分子機制是自由基的過度產(chǎn)生和嚴重的氧化應(yīng)激。因此，具有強抗氧化性的化合物可以通過中和多氧誘導的氧化應(yīng)激來發(fā)揮作用。山奈酚是最常見的膳食類黃酮之一，在許多組織(包括心臟)中都有抗凋亡、抗氧化和抗炎的作用[12]。本文研究表明山奈酚可以保護心肌細胞對抗CoCl2誘導的凋亡，提高SOD活性，清除MDA，降低ROS含量。從上述文獻報道的機制來看，山奈酚作為類黃酮家族一員，除了能增加SOD活性，還可能直接參與消除自由基，從而減輕氧化應(yīng)激造成的細胞凋亡。大量的實驗和臨床研究表明，在衰竭的心肌中，ROS積累是明顯加重[11]。暴露于ROS會導致細胞凋亡、壞死、纖維化，最終引起心律失常、興奮收縮耦合損傷、心臟重構(gòu)[13]。細胞凋亡是缺氧心肌細胞死亡的主要方式[6]。之前研究表明，山奈酚可以通過抑制凋亡保護心肌細胞對抗缺氧/復氧損傷[8]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，山奈酚可以抑制缺氧心肌細胞凋亡。

自噬是細胞溶酶體在嚴格的調(diào)控下的動態(tài)自降解過程，也被認為參與了缺血性心臟病[14]。自噬通常在心臟中維持著較低水平，當出現(xiàn)ATP衰竭、過度ROS和線粒體功能障礙等環(huán)境應(yīng)激時自噬通量急劇上升[15]。適度自噬可促進細胞存活，而過度自噬可加速細胞死亡[16]。因此，自噬作為治療缺血性心臟病的潛在靶點已引起越來越多的關(guān)注。ULK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，對自噬的初始階段至關(guān)重要。ULK1抑制導致早期自噬體結(jié)構(gòu)停滯[17]。自噬抑制最容易的途徑發(fā)生在對mTOR途徑的激活[18]。當ULK1蛋白激酶復合物被抑制時，ULK1對mTOR途徑抑制作用被解除，mTOR途徑自然被激活，從而抑制細胞自噬。mTOR信號通路可以調(diào)節(jié)細胞生長、增殖和死亡相關(guān)的多種相關(guān)功能和機制[19]。心臟mTOR的過表達，可以對心肌缺血損傷產(chǎn)生心臟保護作用，并抑制炎癥反應(yīng)[20]。在本研究中，觀察到CoCl2顯著誘導自噬，表現(xiàn)在CoCl2明顯促進Beclin 1、LC3-Ⅱ和ULK1表達，抑制p62和mTOR表達；而山奈酚以劑量依賴的方式抵消CoCl2誘導的自噬，導致自噬抑制從而發(fā)揮對心肌細胞的保護功能。

總的來說，本研究揭示了山奈酚在體外對CoCl2誘導的缺氧心肌細胞的保護作用：促進缺氧心肌細胞增殖、抑制缺氧心肌細胞凋亡、降低ROS水平和抑制自噬。這種保護作用可能是通過激活mTOR通路來實現(xiàn)的。本研究結(jié)果闡明了山奈酚治療缺血性心臟病的潛力。