甘草甜素通過抑制炎癥反應和氧化應激改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障損傷①

肖 剛 羅 超 彭 形 蔣光元 滕志鵬

(重慶市中醫(yī)院神經(jīng)外科，重慶400021)

自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorr-hage，SAH)屬于嚴重的神經(jīng)外科急癥,死亡率為30%～70%，存活患者部分伴有殘疾，嚴重影響患者生活質量[1]。臨床以及動物研究均顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血會造成血腦屏障破壞、腦水腫、血管內(nèi)皮收縮以及緊密連接分解等導致血腦屏障通透性增加[2]。對于其機制，目前尚未有明確定論。已有研究顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血后會啟動炎癥反應，參與其發(fā)病進展；而抑制氧化應激反應可減少大腦皮層細胞凋亡，防止血腦屏障的破壞[3]。本研究通過建立蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠模型，并給予甘草甜素處理，以探究其對血腦屏障的改善以及與炎癥反應、氧化應激反應的關系，為蛛網(wǎng)膜下腔出血臨床治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF清潔級SD成年雄性大鼠均購自河南省實驗動物中心，許可證號為：SYXK(豫)2016-0002，體重200～260 g，嚴格按照大鼠飼養(yǎng)規(guī)則進行喂養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為50%，光照時間為8：00～20:00，飲用蒸餾水，飼養(yǎng)期間保持飼養(yǎng)房間整潔、通風，定時對鼠籠進行清理。

1.1.2儀器與試劑 甘草甜素(江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司；批號：20150619)；尼莫地平(亞寶藥業(yè)集團股份有限公司；批號：20150822)；IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、3-NT、8-OHDG ELISA試劑盒購自美國Santa Cruz公司，ZO-1、occludin、claudin-5、Bax、Bcl-2兔抗鼠一抗購自美國R&D公司；HRP標記的羊抗兔IgG二抗、β-actin購自美國Abnova公司，RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；BCA測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；蘇木素染色劑購自珠海貝索生物技術有限公司；熒光定量PCR儀購自美國BioRed公司；光學顯微鏡購自上海光學儀器廠；Hitachi透射電子顯微鏡購自日立高新技術公司；凝膠成像儀購自美國GE公司。

1.2方法

1.2.1大鼠SAH模型制備 所有大鼠在模型制備前禁食12 h，腹腔注射10% 3.5 ml/kg水合氯醛麻醉，在腹側正中部位制作縱行切口，將頸動脈鞘部位進行解剖，同時分離頸總、外、內(nèi)動脈后，與頸外動脈遠端進行結扎，并將頸總、內(nèi)動脈用血管夾臨時夾閉，用顯微剪刀于頸外動脈殘端做一小口，于小口處將尼龍線送入，同時解除臨時血管夾，在此期間采用多普勒監(jiān)測腦血流變化，當顯示腦血流突然降低，且顱內(nèi)壓明顯升高時將尼龍線撤回，并結扎頸外動脈。模型制備結束24 h后，隨機選取6只大鼠再次進行麻醉獲取腦組織，對出血量進行評定，并參考文獻[4]中大鼠SAH評分8～12分時為模型制備成功。

1.2.2實驗分組 將大鼠隨機分為假手術、模型組、甘草甜素低、中、高劑量組、陽性組(尼莫地平組)，每組30只大鼠。假手術組大鼠僅將尼龍線送入頸內(nèi)動脈并不刺破血管，假手術組、模型組大鼠均于模型制備結束后次日給藥，經(jīng)側腦室注射DMSO溶液；甘草甜素低、中、高劑量組、陽性組經(jīng)側腦室注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg甘草甜素以及40 mg/kg尼莫地平注射液，所有大鼠均給藥一周，每日一次。

1.2.3各組大鼠神經(jīng)行為學評分 給藥全部結束后，對大鼠神經(jīng)功能進行評定[5]，主要從以下幾個方面進行評定：自主性活性情況、肢體活動度、肢體伸展情況、爬坡、體側本體感覺以及觸須反應，滿分為18分，評分越低說明神經(jīng)功能缺失越明顯。

1.2.4腦組織含水量測定 給藥結束后，每組隨機選取18只大鼠，給藥結束后24、48、72 h腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將大鼠處死取腦，將腦組織置于電子天平中稱重，此時測得重量為濕重，隨后將腦組織放置于80℃恒溫箱中，待腦組織體重不再變化后，記錄所測重量為干重。

1.2.5血腦屏障通透性檢測 給藥結束后，每組隨機選取6只大鼠，采用伊文氏藍滲出量評估法檢測通透性，經(jīng)股靜脈注射2% 4 ml/kg 伊文氏藍，心臟灌注后斷頭取腦，置于4倍體積的甲酰胺中，37℃反應72 h，于酶標儀中620 nm處測定吸光值，繪制標準曲線計算腦組織中伊文氏藍含量。

1.2.6大鼠基底動脈HE染色 給藥結束后，每組隨機選取6只大鼠，處理后獲得腦組織，一部分置于-80℃冰箱中保存。從腦組織中將腦干、基底動脈分離后進行石蠟包埋，置于二甲苯中20 min進行固定，隨后在體積分數(shù)100%、95%、85%、75%的乙醇中均脫水5 min，蒸餾水沖洗后，加入蘇木素染液染色15 min，置于1%鹽酸5 s后，蒸餾水沖洗，隨后滴加伊紅染液進行復染5 min，分別在體積分數(shù)75%、85%、95%、100%中均脫水2 min，滴加二甲苯進行透明處理，最后用中性樹脂進行封片，置于顯微鏡下進行觀察。

1.2.7透射電鏡觀察腦組織超微結構變化情況 取出凍存腦組織，用無菌剪刀剪碎后置于2.5%戊二醛浸泡，添加2%四氧化鋨進行固定，隨后在不同梯度乙醇中各脫水5 min，用樹脂包埋后，采用醋酸鈾與枸杞酸鉛雙重染色后，置于電鏡下觀察腦組織超微結構如腦微血管內(nèi)皮細胞連接情況以及吞飲小泡數(shù)量變化。

1.2.8酶聯(lián)免疫法檢測腦組織中 IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、3-NT、8-OHDG表達 腦組織中 IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、3-NT、8-OHDG水平采用酶聯(lián)免疫法進行檢測，具體參照試劑盒說明書進行操作。

1.2.9反轉錄PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測腦組織中COX-2、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達 參照RNA提取試劑盒進行腦組織總RNA提取，參照逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，RT-PCR引物序列如表1。反應體系：10×cDNA模板1 μl,上下游引物各0.5 μl,H2O 8 μl,2×SYBR Mix 10 μl。按照反應程序95℃ 3 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，72℃ 2 min，40個循環(huán)，72℃延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參基因在CFX manager 軟件上按照2-ΔΔCt算法進行基因相對定量分析。

1.2.10腦組織中丙二醛(Malonaldehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)的測定 采用比色法檢測GSH-Px水平，氮藍四唑光還原法檢測SOD水平，硫代巴比妥酸法檢測MDA水平。

1.2.11蛋白免疫印跡法(Western blot，WB)檢測ZO-1、occludin、claudin-5、Bax、Bcl-2蛋白表達 取出保存的腦組織剪碎后加入蛋白裂解液在冰上放置30 min，離心后收集上清液，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，配制12%分離膠、5%濃縮膠，蛋白上樣量為20 μg，電壓設定在80 V，樣品指示劑到達分離膠后，電壓升高至120 V，電泳結束后，蛋白凝膠移至PVDF膜，冰上行轉膜反應，電壓為100 V，轉膜1 h，用TBST溶液清洗后加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST溶液清洗后，加入一抗，4℃過夜，TBST清洗后加入二抗，室溫下放置2 h，TBST清洗后ECL顯色，置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白變化情況。

2 結果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為學評分結果 與假手術組相比，模型組大鼠神經(jīng)行為學評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，甘草甜素組、陽性組大鼠神經(jīng)行為學評分升高，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

2.2大鼠腦含水量以及血腦屏障通透性檢測結果 與假手術組相比，模型組大鼠腦含水量于給藥后24、48、72 h升高，EB含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，甘草甜素組、陽性組大鼠腦含水量、EB含量下降，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表1 RT-PCR引物序列

Tab.1 RT-PCR primer sequence

GenesF(5′-3′)R(5′-3′)COX-2AGAAAGAAATGGCTGCAGAGCTAGGTTTCCAGTATTGAGiNOSCCTTGTTCAGCTACGCCTTCAAGGCCAAATACCGCATACCICAM-1TTCACACTGAATGCCAGCCCGTCTGCTGAGACCCCTCTTGVCAM-1ATTTTCTGGAGCAAGAAATTATGTCAGAACAACGGAATCCβ-actinAAGTCCCTCACCCTCCCAAAAGAAGCAATGCTGTCACCTTCCC

2.3HE觀察大鼠基底動脈段組織學形態(tài)變化 假手術組基底動脈管腔較大，管腔呈圓形或橢圓形，管壁薄，未出現(xiàn)皺紋，而模型組基底動脈管腔變狹窄，管壁、內(nèi)膜變厚，管壁內(nèi)膜出現(xiàn)褶皺、結構紊亂，血管內(nèi)外膜出現(xiàn)炎性細胞浸潤，而經(jīng)處理后基底動脈有所緩解，隨著甘草甜素處理劑量的增加，基底動脈逐漸恢復正常，見圖1。

表2 神經(jīng)行為學評分結果

Tab.2 Neurobehavioral score

GroupsNeurobehavioral score(score)Sham group17.65±0.43Model group8.76±1.661)Glycyrrhizin-L group10.19±2.512)Glycyrrhizin-M group13.58±3.422)3)Glycyrrhizin-H group15.23±3.282)3)4)Positive group15.95±3.222)

Note：Compared with the sham group，1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

2.4透射電鏡觀察微血管內(nèi)皮細胞連接情況 電鏡結果顯示，正常腦組織血管內(nèi)皮細胞中，吞飲小泡數(shù)量較少，其連接緊密，位于相鄰細胞膜間。模型組內(nèi)皮細胞壁受損，內(nèi)皮細胞緊密連接開放，而經(jīng)處理后內(nèi)皮細胞緊密開放程度有所降低，隨著甘草甜素處理劑量的增加，開放程度下降至正常。見圖2。

2.5大腦皮層細胞凋亡情況 Tunel染色顯示，與假手術組相比，模型組大腦皮層細胞出現(xiàn)大量凋亡，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，甘草甜素組、陽性組大腦皮層細胞凋亡率逐漸降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3、表4。

2.6IL-1β、IL-6、 TNF-α、3-NT、8-OHDG水平測定情況 與假手術組相比，模型組 IL-1β、IL-6、TNF-α、3-NT、8-OHDG水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，甘草甜素組和陽性組IL-1β、IL-6、TNF-α、3-NT、8-OHDG水平均降低，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表3 腦含水量以及血腦屏障通透性測定結果

Tab.3 Determination of brain water content and blood brain barrier permeability

GroupsBrain water content(%)24 h48 h72hEB content(μg/mg)Sham group63.49±6.3365.18±7.3666.72±6.751.88±0.35Model group84.55±7.291)86.71±5.491)84.33±6.781)7.13±0.861)Glycyrrhizin-L group79.64±6.052)81.68±6.432)79.44±7.262)5.88±1.472)Glycyrrhizin-M group72.65±5.882)3)75.62±5.482)3)73.52±7.472)3)4.96±1.082)3)Glycyrrhizin-H group67.44±6.072)3)4)69.44±6.132)3)4)67.66±7.442)3)4)3.79±0.882)3)4)Positive group65.75±7.182)68.75±5.932)65.57±6.432)3.64±0.752)

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

圖1 大鼠腦動脈段組織學形態(tài)(×200)Fig.1 Histologic morphology of cerebral artery segment of rat(×200)Note: A.Sham group；B.Model group；C.Glycyrrhizin-L group；D.Glycyrrhizin-M group；E.Glycyrrhizin-H group；F.Positive group.

圖2 腦組織微血管內(nèi)皮細胞連接情況(×10 000)Fig.2 Connection of microvascular endothelial cells in brain tissue(×10 000)Note: A.Sham group；B.Model group；C.Glycyrrhizin-L group；D.Glycyrrhizin-M group；E.Glycyrrhizin-H group；F.Positive group.

圖3 大腦皮層細胞凋亡情況 Fig.3 Apoptosis of cerebral cortex cellsNote: A.Sham group；B.Model group；C.Glycyrrhizin-L group；D.Glycyrrhizin-M group；E.Glycyrrhizin-H group；F.Positive group.

表4 細胞凋亡率比較

Tab.4 Comparison of cell apoptosis rate

GroupsCell apoptosis rate(%)Sham group0Model group48.56±7.661)Glycyrrhizin-L group40.19±5.512)Glycyrrhizin-M group27.58±8.422)3)Glycyrrhizin-H group15.23±4.282)3)4)Positive group8.98±1.622)

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

2.7腦組織中MDA、 SOD、GSH-Px水平測定結果 與假手術組相比，模型組MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，甘草甜素組和陽性組MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表6。

2.8RT-PCR檢測腦組織中COX-2、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達 與假手術組相比，模型組 COX-2、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達升高，與模型組相比，甘草甜素組和陽性組 COX-2、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達降低，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表7。

2.9WB 檢測ZO-1、occludin、claudin-5、Bax、Bcl-2蛋白表達 與假手術組相比，模型組 ZO-1、occludin、claudin-5、Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高；與模型組相比，甘草甜素組和陽性組 ZO-1、occludin、claudin-5、Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表8，圖4。

表6 腦組織中MDA、 SOD、GSH-Px測定結果

Tab.6 Levels of MDA,SOD and GSH-Px in brain tissue

GroupsMDA(nmol/g)SOD(U/mg)GSH-Px(U/mg)Sham group37.44±3.790.59±0.040.96±0.06Model group75.13±5.681)0.22±0.021)0.55±0.081)Glycyrrhizin-L group66.19±5.222)0.30±0.032)0.61±0.072)Glycyrrhizin-M group55.34±4.862)3)0.38±0.042)3)0.72±0.062)3)Glycyrrhizin-H group43.17±4.132)3)4)0.47±0.052)3)4)0.81±0.052)3)4)Positive group38.46±3.880.52±0.080.88±0.06

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

表5 腦組織中IL-1β,IL-6,TNF-α，3-NT、8-OHDG檢測結果

Tab.5 Levels of IL-1β,IL-6,TNF-α,3-NT and 8-OHDG in brain tissue

Groups IL-1β(ng/g)IL-6(ng/g) TNF-α(ng/g)3-NT(nmol/g)8-OHDG(ng/g)Sham group21.73±2.6932.64±5.125.02±0.8820.78±2.6318.86±1.69Model group58.62±6.911)80.49±7.031)14.88±1.871)67.94±5.661)60.22±5.841)Glycyrrhizin-L group50.43±5.662)69.76±8.192)12.64±1.532)58.71±3.622)51.49±5.062)Glycyrrhizin-M group41.77±6.052)3)60.55±6.162)3)9.89±1.262)3)51.14±3.152)3)42.68±4.862)3)Glycyrrhizin-H group32.44±4.792)3)4)52.33±5.082)3)4)6.65±1.192)3)4)41.66±4.162)3)4)33.49±4.772)3)4)Positive group30.82±4.1150.64±5.226.07±1.0640.79±4.0830.78±4.06

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

表7 腦組織中COX-2、iNOS、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達

Tab.7 Expression of COX-2,iNOS,ICAM-1 and VCAM-1 mRNA in brain tissue

GroupsCOX-2iNOSICAM-1VCAM-1Sham group1111Model group5.07±0.921)2.88±0.421)4.62±0.381)4.42±0.371)Glycyrrhizin-L group4.21±0.772)2.24±0.332)3.88±0.562)3.26±0.442)Glycyrrhizin-M group3.26±0.582)3)1.86±0.292)3)2.74±0.612)3)2.39±0.512)3)Glycyrrhizin-H group2.39±0.722)3)4)1.43±0.332)3)4)1.86±0.432)3)4)1.54±0.422)3)4)Positive group2.14±0.612)1.24±0.372)1.24±0.362)1.15±0.382)

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

表8 ZO-1、occludin、claudin-5、Bax、Bcl-2蛋白表達

Tab.8 Protein expression of ZO-1,occludin,claudin-5,Bax and Bcl-2

GroupsZO-1occludinclaudin-5Bcl-2BaxSham group1.19±0.060.72±0.131.16±0.050.85±0.140.17±0.03Model group0.22±0.031)0.69±0.161)0.18±0.051)0.31±0.051)0.95±0.091)Glycyrrhizin-L group0.49±0.032)0.62±0.142)0.33±0.082)0.40±0.052)0.78±0.092)Glycyrrhizin-M group0.71±0.112)3)0.67±0.122)3)0.76±0.062)3)0.51±0.072)3)0.64±0.132)3)Glycyrrhizin-H group0.97±0.092)3)4)0.70±0.162)3)4)0.92±0.072)3)4)0.67±0.062)3)4)0.48±0.082)3)4)Positive group1.04±0.082)0.60±0.182)1.05±0.062)0.71±0.042)0.21±0.032)

Note：Compared with the sham group,1)P<0.05；compared with the model group，2)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-L group，3)P<0.05；compared with the Glycyrrhizin-M group，4)P<0.05.

圖4 ZO-1、occludin、claudin-5、Bax、Bcl-2蛋白表達Fig.4 Protein expression of ZO-1,occludin,claudin-5,Bax and Bcl-2Note: 1.Sham group；2.Model group；3.Glycyrrhizin-L group；4.Glycyrrhizin-M group；5.Glycyrrhizin-H group；6.Positive group.

3 討論

甘草甜素又稱甘草酸，是從甘草根莖中提取的三萜類化合物，具有抗病毒、抗炎、抗變態(tài)反應、免疫調控等作用。以往甘草甜素在抗腫瘤方面研究較多，近期有研究顯示其在腦損傷保護方面發(fā)揮重要作用[6]。動物研究顯示在大鼠腦缺血前給予甘草甜素可顯著降低大鼠腦組織含水量以及氧化應激指標水平[7]。Luo等[8]研究顯示，大鼠腦缺血后給予甘草甜素能夠抑制中性粒細胞浸潤和炎性細胞因子的活化浸潤，進而發(fā)揮腦保護作用。Zhang等[9]研究顯示甘草甜素能夠抑制TLR-4介導的炎癥反應，進而抑制NF-κB炎癥通路，發(fā)揮抗炎作用保護腦組織。以上研究均表明甘草甜素可保護腦組織，但目前在SAH血腦屏障中研究不多，本研究通過制備SAH大鼠并給予甘草甜素治療，以期探究其作用機制。

改良Garcia評分在SAH后神經(jīng)功能評價方面應用較多，主要從大鼠的姿勢反射能力、活動能力、肢體協(xié)調能力等方面進行評價神經(jīng)功能，本研究結果顯示模型組大鼠神經(jīng)行為學評分降低，治療后大鼠神經(jīng)行為學評分升高，表明模型組大鼠制備成功，SAH后神經(jīng)功能受損，給予甘草甜素后能夠降低神經(jīng)功能損傷。進一步研究顯示模型組大鼠腦含水量于給藥后24、48、72 h升高，EB含量升高，而給予治療后以上指標均降低，說明模型組大鼠出現(xiàn)腦水腫，且血腦屏障通透性增加。伊文氏藍進入血管后與蛋白結合，一般正常狀態(tài)下不能穿過血腦屏障，因此當血腦屏障通透性升高時伊文氏藍含量升高[10]。腦水腫為SAH常見病理特征之一，也是導致患者不良預后的重要原因，腦水腫發(fā)生的主要原因為血腦屏障遭到破壞。本研究結果顯示模型組血腦屏障遭到破壞，導致通透性增加，造成腦水腫，提示保護SAH后血腦屏障的完整，可減輕腦損傷，這可能為SAH的治療方向。

血腦屏障主要由內(nèi)皮細胞、星形膠質細胞、基底膜等組成，是腦內(nèi)毛細血管內(nèi)皮細胞彼此緊密連接，同時與周圍的周細胞、星形膠質細胞等相互作用而形成的屏障系統(tǒng)，其中內(nèi)皮細胞及其緊密連接是決定血腦屏障通透性的關鍵屏障，當內(nèi)皮細胞緊密連接遭到破壞后就會導致血腦屏障破壞，進而引發(fā)大腦內(nèi)環(huán)境不穩(wěn)定，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11]。本研究電鏡結果顯示模型組內(nèi)皮細胞壁受損，內(nèi)皮細胞緊密連接開放，而經(jīng)藥物處理后內(nèi)皮細胞緊密開放程度有所降低，提示SAH后出現(xiàn)血腦屏障損傷主要由于細胞緊密連接遭到破壞造成的，而經(jīng)過藥物治療后有明顯好轉，說明大腦皮層細胞間緊密連接破壞是可逆的。以往臨床研究證實SAH后會引發(fā)短暫腦出血，同時啟動大腦細胞凋亡，造成血腦屏障破壞[12]。本研究Tunel染色結果顯示模型組大腦皮層細胞出現(xiàn)大量凋亡，Bcl-2蛋白表達降低，Bax蛋白表達升高，而經(jīng)甘草甜素處理后細胞凋亡率降低，Bax蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高，表明甘草甜素可降低細胞凋亡，進而保護腦組織。為進一步明確SAH后血腦屏障通透性升高的機制，對細胞緊密蛋白進行檢測，結果顯示ZO-1、occludin、claudin-5蛋白表達降低，而給予甘草甜素治療后緊密蛋白表達明顯升高，說明血腦屏障通透性增高與緊密連接蛋白表達異常有關。

炎癥反應在SAH發(fā)病中占有重要作用。Shao等[13]研究發(fā)現(xiàn)SAH患者血清中NF-κB水平明顯升高，介導的炎癥反應則會推動SAH的進一步發(fā)展。動物研究顯示SAH嚴重程度與機體中IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥指標濃度明顯相關[14]。You等[15]研究顯示在SAH大鼠模型中通過抑制炎癥介質以及NF-κB信號通路能夠緩解SAH引發(fā)的腦損傷。本研究顯示模型組 IL-1β、 IL-6、TNF-α水平升高，而經(jīng)甘草甜素治療后以上指標均降低，提示甘草甜素保護腦組織可能與抑制炎癥反應有關。COX-2、iNOS為參與細胞炎性反應的重要活性酶,在腦水腫、腦缺血中的研究均顯示COX-2、iNOS表達明顯升高[16]。與此一致，本研究顯示模型組中COX-2、iNOS表達均升高，而給予治療后COX-2、iNOS表達降低，表明甘草甜素可抑制炎癥反應活性酶，避免炎癥因子水平的升高而導致的神經(jīng)損傷。

氧化應激反應在SAH腦損傷中也扮演著重要角色。有關研究顯示SAH大鼠在給予還原劑后能夠抑制MDA、活性氧等產(chǎn)生，且能夠增加GSH-Px濃度，提示可通過抗氧化途徑來治療SAH[17]。本研究結果顯示模型組3-NT、8-OHDG、MDA水平升高，SOD、GSH-Px水平降低，而經(jīng)甘草甜素治療后以上指標均得到明顯改善，推測甘草甜素對腦損傷的保護可能是通過抗氧化來實現(xiàn)，這與以往的研究結論相符合[18,19]。3-NT、8-OHDG、MDA為蛋白質、DNA、磷脂損傷的重要標志[20]，給予甘草甜素治療后以上指標均降低提示抗氧化是甘草甜素在SAH后發(fā)揮腦保護的潛在作用機制。SAH氧化應激反應后往往會造成血管內(nèi)皮以及血管平滑肌損傷，ICAM-1、VCAM-1在腦損傷炎癥反應中發(fā)揮重要作用，多項研究均顯示腦缺血后ICAM-1、VCAM-1水平升高可導致白細胞、內(nèi)皮細胞黏附,浸潤至血管外腦實質,導致缺血后炎癥反應放大[21,22]。本研究顯示模型組ICAM-1、VCAM-1水平升高，給予治療后二者水平均降低，表明抑制ICAM-1、VCAM-1表達后能夠降低腦損傷。

綜上所述，甘草甜素能夠改善大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血腦屏障通透性，緩解基底動脈血管痙攣以及內(nèi)皮細胞緊密連接，同時抑制炎癥反應、氧化應激反應，但其精確作用機制與信號通路仍需進一步深入探究。本研究仍存在一定的缺陷，SAH模型可能會受到其他因素的干擾，并不能精確模擬人類SAH出現(xiàn)的腦組織損傷，因此仍需制備更好的SAH模型，來深入研究SAH的發(fā)病機制。