細(xì)葉石仙桃石油醚部位自由基清除活性研究

李培源 莫媛媛

摘要[目的]研究細(xì)葉石仙桃提取物石油醚部位對自由基的清除活性。[方法]采用石油醚溶劑得到細(xì)葉石仙桃石油醚提取物，并研究其對DPPH自由基和羥自由基的清除能力。以蘆丁為對照品，測定其總黃酮含量。[結(jié)果]細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH清除率在高藥液濃度時達(dá)到最大值，對羥自由基清除率最高可達(dá)到100%。[結(jié)論]細(xì)葉石仙桃石油醚提取物具有優(yōu)異的自由基清除活性。

關(guān)鍵詞細(xì)葉石仙桃;DPPH;羥自由基;清除能力;總黃酮含量

中圖分類號TS202.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）01-0174-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.052

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

活性氧（ROS）由自由基（如超氧陰離子和羥基自由基）和非自由基物種（如H2O2和單氧）組成，是不同形式的活性氧。ROS是由所有需氧生物產(chǎn)生的，并且可以容易地與包括蛋白質(zhì)、脂類、lipoproteins和DNA在內(nèi)的大多數(shù)生物分子發(fā)生反應(yīng)。因此，充足的ROS導(dǎo)致各種病理生理紊亂，如關(guān)節(jié)炎、糖尿病、炎癥、癌癥和遺傳毒性。因此，需要使用抗氧化劑來抵抗氧化應(yīng)激和ROS的毒性作用[1-3]。由于合成的抗氧化劑副作用多，近年來科研工作者致力于尋找來源于植物的天然抗氧化劑[4-9]。細(xì)葉石仙桃作為一種常用的草藥，其抗氧化方面的研究未見報(bào)道。通過冷浸法得到細(xì)葉石仙桃石油醚提取物，測定其總黃酮含量，并采用DPPH和羥自由基體系，評估其對自由基的清除能力。

1材料與方法

1.1儀器與材料

UV1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析電子科技有限公司）。細(xì)葉石仙桃藥材購于廣西百色。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購于百靈威試劑公司（北京）。所有試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)葉石仙桃石油醚提取物制備。

稱取20g細(xì)葉石仙

桃粉末，加入200mL石油醚（95%），冷浸72h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到細(xì)葉石仙桃石油醚提取物。

1.2.2總黃酮含量測定。

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測定。

精密吸取蘆丁對照品溶液（lmg/mL）于10mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4mL，靜置6min，加入5%硝酸鋁0.4mL，靜置6min。加5%氫氧化鈉試液4.0mL，用95%石油醚稀釋至刻度，搖勻。靜置15min，在510nm處測定吸收度。以吸收度對溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程。

1.2.2.2細(xì)葉石仙桃石油醚提取物總黃酮含量測定。

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測定吸光度，多次測量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量（mg）表示，并計(jì)算提取得率。

1.2.3二苯基苦味肼基自由基（DPPH）體系[4]。

取不同濃度細(xì)葉石仙桃石油醚提取物溶液（0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0mg/mL）加入8mLDPPH（0.004%）溶液中。在最大波長處（517nm）測吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下：S（%）=（1-A樣品）/A空白×100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

1.2.4羥自由基體系。

以蒸餾水將75mmo1/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋至7.5mmol/L，依次往50mL比色管中加入1.0mL濃度7.5mmol/L鄰二氮菲溶液，5mLpH7.4PBS、1.0mLFeSO4溶液、一定量的抗氧劑溶液、1.0mLH2O2應(yīng)用液，以蒸餾水補(bǔ)充體積至25mL。37℃保溫反應(yīng)60min，測A510。既加抗氧劑，又加H2O2的為加藥管;不加抗氧劑，只加H2O2的為損傷管;未損傷管兩者均不加。羥自由基清除率s=（A加藥-A損傷）/（A未損傷-A損傷）×100%。若為負(fù)值，則此時表現(xiàn)促氧化性;若為正值，則此時表現(xiàn)抗氧化性。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)葉石仙桃石油醚提取物總黃酮含量測定結(jié)果

細(xì)葉石仙桃石油醚提取物總黃酮含量以蘆丁為對照品測定，以吸收度對溶液濃度進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程y=9.6778x+0.0167（R=0.9992）。根據(jù)線性方程得出細(xì)葉石仙桃石油醚提取物的總黃酮含量測定結(jié)果，其總黃酮含量為10.6mg/g。

2.2細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基的清除能力

2.2.1不同濃度提取物對DPPH自由基的清除能力。

不同濃度細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基的清除能力如圖1所示。當(dāng)藥液濃度低于1.5mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率基本維持在一個水平，不同濃度提取物對DPPH自由基的清除率從高到低的順序?yàn)椋?.2mg/mL>0.8mg/mL>0.5mg/mL>1.5mg/mL>0.2mg/mL。當(dāng)藥液濃度高于1.5mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率增加到較高值，藥液濃度為2.0mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值。

2.2.2不同時間提取物對DPPH自由基的清除能力。

細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基的清除能力與反應(yīng)時間之間的關(guān)系如圖2所示。將藥液濃度為2.0mg/mL提取物溶液加入DPPH自由基體系中，立即吸取溶液進(jìn)行清除率測定，測得DPPH自由基清除率為13.7%。在反應(yīng)時間為10min時進(jìn)行測定，細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基的清除能力增大為反應(yīng)時間0min時的1.26倍。對比提取物在反應(yīng)時間10～40min的DPPH自由基清除率，發(fā)現(xiàn)其數(shù)值基本維持在一個水平。

2.3細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對羥基自由基的清除能力

細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對羥基自由基的清除能力與藥液濃度之間的關(guān)系如圖3所示。藥液濃度對于細(xì)葉石仙桃石油醚提取物羥基自由基清除能力的影響很大，在較低濃度（小于0.5mg/mL）時，提取物羥基自由基清除率為負(fù)值，表示細(xì)葉石仙桃石油醚提取物具有促氧化作用。當(dāng)藥液濃度增加到0.8mg/mL，提取物羥基自由基清除率為10.3%，表現(xiàn)出抗氧化性。隨著藥液濃度增加，提取物對羥基自由基清除率增加，在藥液濃度為1.2和1.5mg/mL，提取物羥基自由基清除率分別增加為0.8mg/mL藥液濃度下羥基自由基清除率的6.97倍和8.75倍。

2.4細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH和羥基自由基EC50值的影響

EC50值表示抗氧化劑對自由基清除一半時所需的藥液濃度，細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基的EC50值為21.36mg/mL，對羥自由基的EC50值為1.05mg/mL。結(jié)果表明細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對于羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力，在很低的藥液濃度就對羥自由基達(dá)到半數(shù)抑制。

3結(jié)論

測定細(xì)葉石仙桃石油醚提取物的總黃酮含量，并采用DPPH自由基體系和羥自由基體系來評估其自由基清除活性。以蘆丁為對照品，測得細(xì)葉石仙桃石油醚提取物的總黃酮含量為10.6mg/g。細(xì)葉石仙桃石油醚提取物對DPPH自由基顯示出良好的清除效果，藥液濃度為2.0mg/mL時，提取物對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值，在反應(yīng)時間為10～40min，其數(shù)值基本維持在一個水平。該提取物對羥自由基具有很強(qiáng)的清除能力，在較高濃度時提取物對羥自由基

清除率完全。試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)葉石仙桃石油醚提取物具有優(yōu)異的自由基清除能力。

參考文獻(xiàn)

[1]HALLIWELLB，MURCIAMA，CHIRICOS，etal.Freeradicalsandantioxidantsinfoodaninvivo：Whattheydoandhowtheywork[J].CritRevFoodSciNutr，1995，35（1/2）：7-20.

[2]SUW，LIPY，HUOLN，etal.PhenoliccontentandantioxidantactivityofPhymatopterishastate[J].JSerbChemSoc，2011，76（11）：1485-1496.

[3]TABARTJ，KEVERSC，PINCEMAILJ，etal.Antioxidantcapacityofblackcurrantvarieswithorgan，season，andcultivar[J].JAgricFoodChem，2006，54（17）：6271-6276.

[4]LIPY，HUOLN，SUW，etal.Freeradicalscavengingcapacity，antioxidantactivityandphenoliccontentofPouzolziazeylanica[J].JSerbChemSoc，2011，76（5）：709-717.

[5]MAZORD，GREENBERGL，SHAMIRD，etal.Antioxidantpropertiesofbucillamine：Possiblemodeofaction[J].BiochemBiophResCo，2006，349（3）：1171-1175.

[6]李培源，蘇煒，霍麗妮，等.黃葵籽揮發(fā)油化學(xué)成分及其抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2012，23（3）：603-604.

[7]李培源，盧汝梅，蘇煒，等.地膚子總黃酮含量測定及其抗氧化活性[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（7）：1802-1804.

[8]李培源，盧汝梅，蘇煒，等.萆薢總黃酮含量測定及其抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2015，26（6）：1303-1304.

[9]李培源，霍麗妮，賈智若，等.龍膽草抗氧化活性和總黃酮含量測定研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（31）：182-183.