鄂西南地區(qū)稻瘟病菌最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基篩選

鄭潔 安樂(lè) 鄧森文 黎艷艷 王春臺(tái) 徐鑫

摘要[目的]篩選鄂西南地區(qū)稻瘟病菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。[方法]從鄂西南地區(qū)稻瘟病菌生理小種文庫(kù)中選擇優(yōu)勢(shì)菌株，在米糠培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基，以及以上3種材料按比例混配的4種組合培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。[結(jié)果]同種菌株在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率不同，不同菌株在同一種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率不同，在含有米糠、燕麥、馬鈴薯3種成分的M7培養(yǎng)基上稻瘟菌生長(zhǎng)量最大。[結(jié)論]M7培養(yǎng)基為鄂西南地區(qū)稻瘟菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞稻瘟病菌;生長(zhǎng)速率;培養(yǎng)基;鄂西南地區(qū)

中圖分類(lèi)號(hào)S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0127-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.039

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

稻瘟病由稻梨孢菌（Magnaportheoryzae）所引起，每年由稻瘟病菌導(dǎo)致的稻瘟病減產(chǎn)的水稻總量相當(dāng)于6000萬(wàn)人口的年糧食需求量[1]。武陵山區(qū)地屬亞熱帶季風(fēng)性山地濕潤(rùn)氣候，雨熱同季，降水充沛，導(dǎo)致該地區(qū)經(jīng)常暴發(fā)稻瘟病[2-3]，且其境內(nèi)地形地貌復(fù)雜多樣，海拔高低懸殊，水稻種植的品種和時(shí)間具有顯著差異，導(dǎo)致該地區(qū)的稻瘟病菌生理小種品種十分豐富[4]。

病原菌與作物之間存在互作，通過(guò)研究稻瘟病菌的群體結(jié)構(gòu)及遺傳變異信息，有助于指導(dǎo)開(kāi)展抗瘟育種和合理利用抗性，延長(zhǎng)品種的抗病使用年限[5]。近年來(lái)，對(duì)稻瘟病菌遺傳多樣性的研究在全國(guó)各地越來(lái)越普遍。研究表明，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌生理小種[6]的優(yōu)勢(shì)群體與黑龍江[7]、湖南[8]、貴州[9]等地有較大差別。不同的稻瘟病菌生理小種，適合的培養(yǎng)基可能不同[10]，常用的配制方便且價(jià)格經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基包括燕麥片培養(yǎng)基[6，11]、米糠培養(yǎng)基[12-13]和PDA培養(yǎng)基[14]等。筆者選取上述3種培養(yǎng)基以及各組分混配的組合培養(yǎng)基進(jìn)行稻瘟病菌不同生理小種最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)，明確鄂西南地區(qū)水稻稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)種群的最適培養(yǎng)條件，旨在為該地區(qū)稻瘟病菌遺傳多樣性研究及水稻抗病品種的選育提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株。

所用稻瘟病菌生理小種B31-2及B6-5[6]由武漢中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2供試培養(yǎng)基。

M1：米糠20g，清水1000mL，瓊脂20g;M2：燕麥片30g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M3：切塊馬鈴薯200g，清水1000mL，葡萄糖20g，瓊脂18g;M4：切塊馬鈴薯100g，燕麥片15g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M5：切塊馬鈴薯100g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M6：燕麥片15g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g;M7：切塊馬鈴薯70g，燕麥片15g，米糠10g，清水1000mL，蔗糖15g，瓊脂7g。

1.2方法

1.2.1稻瘟病菌活化。

從保存菌種B31-2和B6-5的濾紙條上剪下一小片置于燕麥培養(yǎng)基中心，將提前準(zhǔn)備好的直徑6mm的滅菌圓形濾紙片以菌株為中心呈包圍狀置于培養(yǎng)基表面，27℃培養(yǎng)7d左右，至菌絲長(zhǎng)滿濾紙片。

1.2.2稻瘟病菌培養(yǎng)。

取長(zhǎng)滿菌絲的濾紙圓片分別置于7種培養(yǎng)基中心，27℃培養(yǎng)，分別在第3、5、7天時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)速度，重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行比較。于培養(yǎng)第7天拍照記錄菌落形態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1同一菌株在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

通過(guò)對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)第7天的菌落形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)不同稻瘟病菌生理小種在相同培養(yǎng)基上具有相似的菌落形態(tài)，而同一稻瘟病菌生理小種在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差異較大，與許鳴一[10]的研究結(jié)果一致。由圖1可知，稻瘟菌在M1培養(yǎng)基上菌體呈淺褐色，表面平整，菌落中部有少數(shù)白色氣生菌絲;在M2培養(yǎng)基上呈深黑色，表面平整，菌落中心有極少數(shù)白色氣生菌絲;在M3培養(yǎng)基上菌體呈灰綠色，表面有褶皺，菌落中心及邊緣有白色氣生菌絲，且菌落邊緣呈羽毛狀;在M4培養(yǎng)基上菌體呈淺灰色，表面褶皺明顯，中心聚集灰色菌絲，邊緣有灰白色菌絲均勻且密集分布;在M5培養(yǎng)基表面菌體為淡灰色，表面有較深放射狀褶皺，菌落邊緣遍布白色菌絲;在M6培養(yǎng)基表面菌體為墨綠色，表面平整，覆有豐富灰色菌絲;在M7培養(yǎng)基表面菌體為淺灰色，表面有褶皺，菌落邊緣不整齊，為淡綠色點(diǎn)狀分布，并伴有少數(shù)白色菌絲。

2.2不同菌株在不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)量變化

由圖2和3可知，在不同培養(yǎng)基上，不同菌株的生長(zhǎng)曲線均呈快速線性增長(zhǎng)。由圖4、5可知，在不同培養(yǎng)基上，同一種菌株的生長(zhǎng)速率不一致。不同種菌株在同一種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率也不一致。菌株B6-5在M1～M77種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7d的直徑分別為3.92、4.49、4.74、4.84、4.90、4.86、5.04cm。菌株B31-2在7種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7d的直徑分別為3.87、4.21、4.11、4.45、4.69、4.52、4.90cm。

分別取培養(yǎng)3、5、7d的原始數(shù)據(jù)減去平均數(shù)，得到同一菌株在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時(shí)間的相對(duì)菌落直徑，采用F檢驗(yàn)[15]的方法對(duì)其進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，不同菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量存在顯著差異。差異顯著性測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)3d時(shí)，相同菌株在7種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量不存在顯著差異，培養(yǎng)5和7d時(shí)，相同菌株在7種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)量存在顯著差異。由于稻瘟病菌培養(yǎng)一般在7d以上，在培養(yǎng)7d時(shí)，不同菌株和不同培養(yǎng)基間具有顯著差異，由此可知，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)生理小種在M7培養(yǎng)基上稻瘟菌生長(zhǎng)速率最大。

3結(jié)論與討論

該研究選取較為經(jīng)濟(jì)及廣泛使用的3種培養(yǎng)基（米糠培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基以及馬鈴薯培養(yǎng)基）及3種成分按比例混合的組合培養(yǎng)基進(jìn)行了試驗(yàn)，將鄂西南地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌株B31-2及B6-5在7種培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d的菌落直徑進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鄂西南地區(qū)稻瘟病菌優(yōu)勢(shì)生理小種在7種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快的為M7培養(yǎng)基，其次是M4～M6培養(yǎng)基，而在M1～M3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率均比組合培養(yǎng)基慢。由此可知，米糠、燕麥、馬鈴薯這3種成分的存在協(xié)同促進(jìn)稻瘟病菌菌絲的生長(zhǎng)。

與許鳴一[10]的研究結(jié)果一致，菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率大于米糠培養(yǎng)基和燕麥培養(yǎng)基，這可能是由于PDA中含氮量高，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)速率較快。吳斯駿等[16]使用江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的菌株群體ZB13進(jìn)行試驗(yàn)，配制出了一種新型的稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基（秸稈浸出液：PDA=1∶1，V/V）。該研究選用的材料經(jīng)濟(jì)成本相對(duì)較高。后續(xù)可將秸稈浸出液這一成本經(jīng)濟(jì)、來(lái)源便捷的材料加入試驗(yàn)，觀察含有4種成分的培養(yǎng)基對(duì)稻瘟病菌生長(zhǎng)是否具有促進(jìn)作用。

稻瘟病菌的生長(zhǎng)速率與產(chǎn)孢能力不呈正相關(guān)。孫國(guó)昌等[17]研究表明，米糠培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量弱于玉米粉稻稈瓊脂

培養(yǎng)基，與其不一致的是，蘭波等[12]研究表明，稻瘟病菌在

米糠培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大。該差異可能與使用的供試菌株不同有關(guān)。該研究選用的菌株為2012年從鄂西南地區(qū)感

病稻稈上分離得到的野生菌株，與前人進(jìn)行試驗(yàn)的菌株有差別，因此，選取鄂西南地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)M7培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)孢量的分析很有必要。

為了進(jìn)一步對(duì)M7培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，主要從以下3個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)和完善：加大供試菌株數(shù)目，并選取不同年間的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行試驗(yàn);進(jìn)行正交試驗(yàn)，得到4種成分的最佳配比;進(jìn)行產(chǎn)孢試驗(yàn)并做活體接種觀察其孢子致病性，在最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上篩選最優(yōu)產(chǎn)孢培養(yǎng)基。

參考文獻(xiàn)

[1]ZHAOHJ，WANGXY，JIAYL，etal.ThericeblastresistancegenePtrencodesanatypicalproteinrequiredforbroad-spectrumdiseaseresistance[J].NatCommun，2018，9（1）：2039.

[2]吳雙清，王林，卿明鳳.水稻區(qū)試品種抗稻瘟病鑒定結(jié)果分析[J].中國(guó)稻米，2011，17（4）：53-55.

[3]姚燕.湖北省建始縣水稻稻瘟病的成因及防治[J].北京農(nóng)業(yè)，2015（3）：107.

[4]李求文，楊隆維，吳雙清，等.武陵山區(qū)水稻抗稻瘟病品種的選育與利用[J].種子，2008，27（3）：95-97.

[5]伍尚忠，朱小源，楊祁云，等.應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒證稻瘟病菌宗譜與寄主遺傳背景的親緣關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32（6）：56-62.

[6]田珂，楊武，李泌，等.鄂西南地區(qū)2012-2014年稻瘟病菌致病性變化分析[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（5）：10-14.

[7]郭麗穎，趙宏偉，王敬國(guó)，等.黑龍江省稻瘟病菌生理小種鑒定和主栽水稻品種抗病性及遺傳多樣性分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（8）：1444-1454.

[8]李亞，劉二明，戴良英，等.湖南稻瘟病菌群體遺傳多樣性與病菌致病型的關(guān)系[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2007，21（3）：304-308.

[9]姜于蘭，譚萍，向紅瓊.貴州省稻瘟病菌遺傳譜系與生理小種關(guān)系[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（12）：2438-2441.

[10]許鳴一.稻瘟病菌四種生理小種的形態(tài)和生長(zhǎng)特性研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2011.

[11]龍子文，周杰，王春臺(tái)，等.鄂西地區(qū)稻瘟病菌生理小種文庫(kù)的構(gòu)建及初步鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（24）：12065-12067.

[12]蘭波，李湘民，楊迎青，等.稻瘟病菌產(chǎn)孢技術(shù)研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（2）：74-76.

[13]霍秀娟，李朝生，韓美麗，等.灰梨孢菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43（5）：605-608.

[14]張亞玲，靳學(xué)慧.不同稻瘟病菌菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（10）：295-298.

[15]王寶華，鄭武，魯國(guó)東，等.稻瘟菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選[J].福建農(nóng)業(yè)科技，2000（2）：1-2.

[16]吳斯駿，孫強(qiáng)，陳洪凡，等.一種稻瘟病菌培養(yǎng)產(chǎn)孢培養(yǎng)基的配制與效比分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（18）：118-120.

[17]孫國(guó)昌，申宗坦，孫漱沅.稻瘟病菌產(chǎn)孢條件的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，16（1）：51-54.