煙蒜輪作模式下煙苗根際土粗提物成分研究

張銳靜 張書(shū)暢 蘇嘉騏 曾慶賓

摘要[目的]研究煙蒜輪作對(duì)高海拔地區(qū)烤煙生產(chǎn)發(fā)育的影響，以及與之關(guān)聯(lián)的根際土壤提取物成分變化，進(jìn)而探索緩解高海拔烤煙連作障礙的煙蒜輪作模式。[方法]在海拔約1500m連續(xù)單季連作烤煙8年以上的煙區(qū)引進(jìn)溫江大蒜、金鄉(xiāng)大蒜、中蒜1號(hào)，調(diào)查煙蒜輪作對(duì)云煙87生長(zhǎng)發(fā)育的影響，通過(guò)GC-MS對(duì)根際土的乙醇提取物進(jìn)行組分分析，初步確定可能與煙蒜輪作效應(yīng)關(guān)聯(lián)的根際土化學(xué)成分。[結(jié)果]大蒜輪作顯著提高烤煙農(nóng)藝性狀，大蒜品種間存在輪作效應(yīng)差異，小瓣蒜類型的溫江大蒜因密植輪作效應(yīng)最好。煙苗根際土粗提物組分以酯類為主，其次為有機(jī)酸、酚苯類、醇類等化感物質(zhì)。3種大蒜輪作處理下，煙苗根際土壤中的酯類物質(zhì)種類和豐度顯著降低，總有機(jī)組分?jǐn)?shù)量增加，推測(cè)可能與煙蒜輪作效應(yīng)有關(guān)。[結(jié)論]溫江大蒜在高海拔地區(qū)輪作效應(yīng)最好。

關(guān)鍵詞連作障礙;煙蒜輪作;根際土;GC-MS;煙草;高海拔煙區(qū)

中圖分類號(hào)S153.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0141-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.043

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

由于高海拔煙田種植條件差，普通作物越冬困難，煙農(nóng)種植習(xí)慣落后等原因，高海拔煙區(qū)春夏季常年連作煙草（Nicotianatabacum），秋冬季閑置，復(fù)種指數(shù)低。此種簡(jiǎn)單、粗獷的單季連作模式不僅使土地綜合利用效率低下，而且導(dǎo)致烤煙連作障礙嚴(yán)重，主要體現(xiàn)在病蟲(chóng)害頻發(fā)，肥料利用率不斷下降，烤煙產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降[1]。合理的耕作制度和農(nóng)藝措施是克服烤煙連作障礙的有效手段，如稻草還田、水肥耦合等[2]。相關(guān)研究主要集中在不同栽培制度對(duì)烤煙產(chǎn)量、品質(zhì)以及對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響[3-6]。

煙草忌連作，其連作障礙的主要誘因包括植煙土壤非均衡性富集和耗減嚴(yán)重導(dǎo)致的土壤養(yǎng)分劣化、失衡，根際微生態(tài)失調(diào)，以及化感自毒作用[7-8]。高欣欣等[9]、于會(huì)泳等[10]通過(guò)GC-MS檢測(cè)推測(cè)烤煙化感物質(zhì)可能是有機(jī)酸類、酰胺類、酯類以及甘油和煙堿。符建國(guó)等[11]通過(guò)比較連作與水旱輪作烤煙根系分泌物成分，推測(cè)烤煙根系分泌物自毒作用的主要原因是酸性有機(jī)組分。郭亞利等[12]研究表明，烤煙根系分泌物尤其是酚酸類物質(zhì)達(dá)到一定濃度時(shí)可抑制烤煙種子發(fā)芽、幼苗生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收。

大蒜（Alliumsativum）根系分泌物具有良好的抗菌消毒作用，是烤煙理想的輪作作物[13]。研究表明，雖然新鮮大蒜揮發(fā)物和提取物對(duì)烤煙發(fā)芽和生長(zhǎng)有抑制作用，但前茬大蒜土壤對(duì)煙苗生長(zhǎng)無(wú)顯著抑制作用[14]。黃光榮等[15]比較了油菜-烤煙，小麥-烤煙及大蒜-烤煙3種輪作栽培模式，發(fā)現(xiàn)煙蒜輪作效應(yīng)最佳。事實(shí)上，大蒜根系分泌物對(duì)萵苣、辣椒、蘿卜、黃瓜、白菜和番茄等蔬菜作物均有促進(jìn)作用[16-17]。陽(yáng)顯斌等[4-5]研究表明煙蒜輪作與煙蒜套種均能提高煙葉質(zhì)量，且煙蒜輪作效果最明顯。

盡管不同輪作模式在烤煙生產(chǎn)上已有不少探索和實(shí)際應(yīng)用，其輪作效應(yīng)的土壤理化性質(zhì)基礎(chǔ)也有不少報(bào)道，然而輪作效應(yīng)與根際土壤有機(jī)物成分變化的關(guān)系研究甚少。筆者在高海拔煙區(qū)引進(jìn)3個(gè)大蒜品種，比較前茬大蒜的烤煙根際土壤與連作烤煙根際土壤的粗提物組分，初步解釋了煙蒜輪作效應(yīng)的化學(xué)基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料大蒜品種為溫江大蒜、金鄉(xiāng)大蒜、中蒜1號(hào)。其中，中蒜1號(hào)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉所國(guó)家無(wú)性繁殖及多年生蔬菜資源圃最新選育品種。選取無(wú)病斑、無(wú)機(jī)械損傷的蒜頭作為種蒜。溫江大蒜的種植密度為30萬(wàn)株/hm2，由于金鄉(xiāng)大蒜和中蒜1號(hào)屬于大瓣蒜，故種植密度設(shè)置為27萬(wàn)株/hm2。供試烤煙品種為云煙87，由四川省煙草公司攀枝花市公司提供。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)輪作的試驗(yàn)地點(diǎn)為攀枝花市米易縣攀蓮鎮(zhèn)雙溝村，海拔約1500m。采用田間小區(qū)試驗(yàn)，隨機(jī)設(shè)計(jì)。設(shè)置烤煙-溫江大蒜、烤煙-金鄉(xiāng)大蒜、烤煙-中蒜1號(hào)3個(gè)輪作處理?？紤]到邊際效應(yīng)、坡度、肥力差異等因素，在每個(gè)輪作處理的旁邊設(shè)置空白對(duì)照（即烤煙單季連作模式）。每個(gè)輪作處理和相應(yīng)空白對(duì)照均設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)面積約100m2。在整個(gè)大蒜和烤煙的生育期內(nèi)，輪作處理與空白對(duì)照施肥、澆水保持完全相同。

1.3測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1大蒜生育期。調(diào)查和記錄大蒜出苗期、蒜薹采收期、蒜頭采收期。

1.3.2大蒜后茬烤煙性狀。每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取20株煙株掛牌定株，對(duì)煙草旺長(zhǎng)期、采收期的田間長(zhǎng)勢(shì)進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查項(xiàng)目包括株高、葉數(shù)、節(jié)距、莖圍。

1.3.3大蒜后茬烤煙根系分泌物檢測(cè)。

運(yùn)用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定烤煙根際土的粗提成分。在煙株移栽45d后，沿著烤煙植株根系周?chē)陂_(kāi)土壤取出完整植物根系土壤，輕輕抖動(dòng)去掉在根系附著的較松散土壤，后抖動(dòng)收集與根附著緊密的土壤為根際土壤，過(guò)60目篩，放置冰箱備用。

用萃取的方法對(duì)根際土有機(jī)組分進(jìn)行粗提。取土樣30g，加入85%乙醇200mL，磁力攪拌器攪拌浸提24h。用高速離心機(jī)在3500r/min條件下離心15min，取上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50mL。乙酸乙酯（1：1）萃取2次，物相中性。用1mol/L鹽酸將水相pH調(diào)至3.0，再用等量乙酸乙酯萃取2次，物相酸性。將分液漏斗中的水相用1mol/LNaOH溶液調(diào)pH至8，等量乙酸乙酯萃取2次，物相堿性。合并酸性、中性、堿性條件下的萃取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，并用乙酸乙酯定容至5mL，用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，為烤煙根際土粗提物液待測(cè)樣品。

色譜儀為安捷倫7890A，毛細(xì)管柱為HP-5，進(jìn)樣口溫度為250℃。程序升溫：柱溫50℃（2min），以6℃/min速率升溫至250℃，并保持15min。載氣為高純氦氣，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量1μL。質(zhì)譜儀為安捷倫5975C，掃描范圍m/z為30～600amu，掃描速度0.2s。離子源溫度200℃，四級(jí)桿溫度150℃。不分流進(jìn)樣品。通過(guò)搜索計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)NIST2011初步確定組分，僅考慮匹配得分≥70且在同一保留時(shí)間在3個(gè)重復(fù)中均出現(xiàn)的組分。取3個(gè)重復(fù)的峰面積平均值進(jìn)行簡(jiǎn)單定量分析。

2結(jié)果與分析

2.1煙蒜輪作對(duì)烤煙生長(zhǎng)發(fā)育的影響

分別在旺長(zhǎng)期和采收期，調(diào)查大蒜輪作模式對(duì)烤煙主要農(nóng)藝性狀的影響。由表1可知，不同對(duì)照地塊的云煙87長(zhǎng)勢(shì)有差異，表明存在土壤肥力不均的現(xiàn)象。但將大蒜輪作處理與其相鄰的連作對(duì)照進(jìn)行比較，前茬大蒜的煙草在株高和最大葉上顯著高于對(duì)照，表明大蒜的輪作效應(yīng)顯著。大蒜輪作對(duì)煙草莖圍無(wú)顯著影響。3種大蒜輪作對(duì)煙草長(zhǎng)勢(shì)的促進(jìn)程度具有品種差異。溫江大蒜、金鄉(xiāng)大蒜、中蒜1號(hào)對(duì)旺長(zhǎng)期株高的提高幅度分別為19.0%、15.4%、16.6%。這可能是由于溫江大蒜是小頭蒜，其種植密度高于金鄉(xiāng)大蒜和中蒜1號(hào)，因而輪作效應(yīng)更明顯。

2.2煙蒜輪作對(duì)大蒜生育期和經(jīng)濟(jì)效益的影響

由于高海拔煙田肥力較差，后期慎重追肥，3種大蒜在連作煙田的產(chǎn)量均低于平原地區(qū)。由表2可知，中蒜1號(hào)產(chǎn)量最高，經(jīng)濟(jì)效益最好，金鄉(xiāng)大蒜其次，最差的為溫江大蒜。比較3個(gè)大蒜品種在高海拔的生育期特征，溫江大蒜出苗早，苗期最短，為41d;其次為中蒜1號(hào)，三者中最晚的為金鄉(xiāng)大蒜，二者的苗期分別為51和46d。無(wú)論是蒜薹采收還是老蒜采收，溫江大蒜均遠(yuǎn)早于金鄉(xiāng)大蒜和中蒜1號(hào)?？紤]到溫江大蒜輪作模式不影響后茬煙苗移栽，在高海拔煙區(qū)最宜與煙草輪作的是溫江大蒜。

2.3煙蒜輪作對(duì)煙草根際土粗提物成分的影響

2.3.1溫江大蒜輪作。

在煙草苗期，搜集根際土，用GC-MS分析其粗提物成分，比較溫江大蒜輪作模式和煙草連作模式。由表3可知，前茬溫江大蒜輪作的根系土壤中共檢測(cè)到21種物質(zhì)，酯類物質(zhì)10種，有機(jī)酸4種，酚苯類3種，醇、酮類3種，以及1-甲基萘。酯類物質(zhì)豐度最高，達(dá)83.38%，其次為有機(jī)酸類，達(dá)3.54%。丙酸乙酯含量占23.22%。從連作土壤中，共檢測(cè)到16種物質(zhì)，酯類物質(zhì)11種，有機(jī)酸1種，酚苯類3種，以及環(huán)己酮。酯類物質(zhì)含量最高，達(dá)98.56%，丙酸乙酯占比達(dá)87.7%。輪作與連作共有的成分有丙酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯等13類物質(zhì)。大蒜輪作處理顯著增加的物質(zhì)僅為丁酸乙酯，顯著降低的物質(zhì)有丙酸乙酯、乙酸丁酯、環(huán)己酮。輪作模式和對(duì)照分別檢測(cè)到8種和3種獨(dú)有成分，但總體含量均不高。丙酸乙酯和乙酸丁酯含量占比較大（>1.5%），可能與煙蒜輪作效應(yīng)有關(guān)。

2.3.2金鄉(xiāng)大蒜輪作。

比較金鄉(xiāng)大蒜輪作模式和煙草連作模式下煙苗根際土粗提物組分，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，前茬金鄉(xiāng)大蒜輪作中共檢測(cè)到23種物質(zhì)，酯類6種，有機(jī)酸3種，酚苯類5種，烷烴類4種，醇、酮類4種，以及甲基萘。通過(guò)比較峰面積，酯類物質(zhì)含量最高，達(dá)95.13%;其中丙酸乙酯占比最高，達(dá)90.9%。其他組分含量很少，酸類1.00%，醇類1.18%，酚苯類0.81%，烷烴類0.48%，苯類0.42%。從連作土壤中共檢測(cè)到17種物質(zhì)，酯類物質(zhì)含量最高，達(dá)97.58%。另外，連作土僅檢測(cè)到3種酚苯類，含量為0.44%，3種醇、酮類含量為1.67%，未檢測(cè)到烷烴類和有機(jī)酸類物質(zhì)。輪作與連作共有組分10種。大蒜輪作處理顯著增加的物質(zhì)只有2，4-二（1，1-二甲基乙基）苯酚，顯著降低的組分有丙酸乙酯、乙酸丁酯和γ-谷甾醇。輪作模式和對(duì)照分別檢測(cè)到13種和7種獨(dú)有成分。這些獨(dú)有組分中含量較高的有鄰苯二甲酸異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯，在輪作樣本中未檢測(cè)到。丙酸乙酯、乙酸丁酯、鄰苯二甲酸異丁酯含量占比較大（>1.5%），可能與煙蒜輪作效應(yīng)有關(guān)。

2.3.3中蒜1號(hào)大蒜輪作。

比較中蒜1號(hào)輪作模式和煙草連作模式下煙苗根際土粗提物組分，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，中蒜1號(hào)輪作土壤中共檢測(cè)到19種物質(zhì)，酯類8種，有機(jī)酸4種，醇、酮類3種，烷烴類1種，酚苯類1種。對(duì)照共檢測(cè)出16種物質(zhì)，酯類9種，酚苯類2種，醇類2種，有機(jī)酸1種，烷烴類1種，以及甲基萘。無(wú)論是輪作處理還是連作對(duì)照，酯類組分含量最高，分別達(dá)82.35%和94.01%。在輪作和連作樣本中，組分含量次高的分別是有機(jī)酸類（15.90%）和醇酮類（3.98%），其他組分含量均很少。輪作與連作共有組分12種。中蒜1號(hào)輪作處理顯著提高的組分有亞油酸乙酯和亞油酸，顯著降低的組分有丙酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、β-谷甾醇。輪作模式和對(duì)照分別檢測(cè)到7種和4種獨(dú)有成分。在輪作中未檢測(cè)到且在對(duì)照中含量較高的有油酸乙酯，僅在輪作中檢測(cè)到且含量較高的有棕櫚酸、亞麻酸、硬脂酸。由此可知，中蒜1號(hào)輪作大大增加了有機(jī)酸含量。

丙酸乙酯、鄰苯二甲酸異丁酯、油酸乙酯、β-谷甾醇以及有機(jī)酸含量占比較大（>1.5%），可能與煙蒜輪作效應(yīng)有關(guān)。

2.3.4不同大蒜品輪作處理間差異。

比較3種大蒜品種引起的根際土有機(jī)組分差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輪作導(dǎo)致酯類組分?jǐn)?shù)降低，有機(jī)酸類組分?jǐn)?shù)增加（圖1A）。這在不同大蒜品種間得到互相印證。其他類別的有機(jī)組分如醇酮類、酚苯類、烷烴類變化一致性不明顯。對(duì)具體有機(jī)組分而言，丙酸乙酯含量在3個(gè)輪作處理中均為下降，尤其在溫江大蒜輪作處理中，下降幅度高達(dá)96.25%（圖1B）。此外，乙酸丁酯和亞油酸乙酯在溫江大蒜輪作處理中也大幅度降低。鄰苯二甲酸異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯在金鄉(xiāng)大蒜輪作處理中大幅下降。中蒜1號(hào)輪作處理大幅度降低β-谷甾醇和乙酸十三烷含量，大幅度增加有機(jī)酸類和庚烷類含量。這表明不同大蒜品種輪作導(dǎo)致的煙苗根際土有機(jī)組分變化既存在較大的一致性，也存在較大的差異性。有機(jī)組分?jǐn)?shù)的增加和酯類含量的減少可能是大蒜輪作效應(yīng)的土壤化學(xué)基礎(chǔ)。

3結(jié)論與討論

該研究探討了不同類型、不同品種的大蒜在高海拔煙區(qū)輪作效應(yīng)的差異和輪作模式的優(yōu)劣。研究表明，煙蒜輪作效應(yīng)顯著的有玉米[3]、水稻[11]、大蒜[5]等，不適宜進(jìn)行輪作的有辣椒和大豆[3]。玉米和水稻由于生育期與烤煙沖突，正常情況下與烤煙僅實(shí)行隔年輪作，不能達(dá)到提高復(fù)種指數(shù)的目的。作為秋冬茬口的大蒜耐低溫，經(jīng)濟(jì)效益高，能實(shí)現(xiàn)周年輪作模式。該試驗(yàn)比較了3種不同大蒜品種與烤煙輪作的種植模式。結(jié)果表明，3個(gè)大蒜品種的輪作效應(yīng)明顯。這與前人的研究結(jié)果相符[15]。3個(gè)大蒜品種中，溫江大蒜是典型的小蒜瓣品種，主要種植區(qū)域?yàn)樵瀑F川渝;金鄉(xiāng)大蒜和中蒜1號(hào)均勻大瓣蒜，主要在北方種植。結(jié)果表明，溫江大蒜輪作效應(yīng)最顯著。這可能是由于在相同土壤肥力及施肥條件下，溫江大蒜植株蒜頭較小，植株密度大，對(duì)連作煙土的改良效果最好。另外，在高海拔煙區(qū)條件下，由于冬春氣溫較低，大蒜生長(zhǎng)被抑制，所有大蒜品種的生育期均變長(zhǎng)，平均比低海拔延長(zhǎng)20～40d。溫江大蒜相對(duì)其他2個(gè)品種生育期較短，整個(gè)生育期在200d左右，剛好能與煙實(shí)現(xiàn)輪作。綜合比較，小瓣蒜適宜高海拔煙區(qū)煙蒜輪作模式。

該研究結(jié)果表明，煙苗根際土粗提物主要有機(jī)成分為酯類，占比在80%以上。其次為有機(jī)酸類。高欣欣等[9]在酸性、中性、堿性提取物中均檢測(cè)到大量有機(jī)酸，最高含量分別為丁二酸（54.13%）、肉豆蔻酸（63.65%）、棕櫚酸（22.43%）。于會(huì)永等[10]分析烤煙根系分泌物，發(fā)現(xiàn)酸性、中性、堿性提取物中含量最高的均為酯類，分別為47.75%、69.09%、47.17%，其中最高的都是鄰苯二甲酸二丁酯。不同研究結(jié)果差異很大，這與烤煙的種植方式、生長(zhǎng)狀況以及根系分泌物的搜集方式和檢測(cè)方法有關(guān)。溫度和水分條件等細(xì)微環(huán)境變化也能影響根系分泌物組分含量[18]。該研究從煙苗根際土測(cè)定的粗提物成分還包含前茬大蒜殘留物以及其他土壤化學(xué)物質(zhì)。盡管從嚴(yán)格意義上講并不完全是烤煙根系分泌物，但對(duì)分析大蒜輪作效應(yīng)的綜合土壤化學(xué)基礎(chǔ)具有重要意義。

對(duì)比3種大蒜輪作處理下煙苗根際土粗提物有機(jī)組分的動(dòng)態(tài)變化，總有機(jī)組分?jǐn)?shù)增加以及酯類組分?jǐn)?shù)量和含量減少可能是大蒜輪作效應(yīng)的土壤化學(xué)基礎(chǔ)。有機(jī)組分多樣化有利于構(gòu)建健康的土壤微生態(tài)環(huán)境，平衡煙苗土壤養(yǎng)分吸收。研究表明，煙蒜輪作提高根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量高于烤煙連作，尤其是解鉀菌、解磷菌等活化土壤養(yǎng)分的有益菌[4]。而煙草根系分泌物具有促進(jìn)病原菌（茄科勞爾氏菌）抑制拮抗菌（芽孢桿菌）的負(fù)面作用[19]。酯類物質(zhì)減少，可能減少烤煙根系分泌物的自毒作用。人工加入烤煙根系分泌物提取液顯著降低煙苗根系活力，降低根系對(duì)NO3-、PO43-、K+的吸收，抑制幼苗的生長(zhǎng)，大蒜輪作作為解決烤煙連作障礙的重要手段之一[12]。從土壤農(nóng)化性狀、土壤微生物類群2個(gè)方面進(jìn)行研究。該研究利用GC/MS檢測(cè)輪作處理下煙苗根際土粗提物有機(jī)成分，從另一個(gè)角度初步解釋輪作效應(yīng)的土壤化學(xué)基礎(chǔ)，下一步將進(jìn)一步鑒定主要有機(jī)組分與大蒜輪作效應(yīng)的關(guān)系。

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