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    低溫脂肪酶菌株的誘變篩選及酶學(xué)特性研究

    2019-05-14 08:59:55王興吉賈仁潔王克芬劉文龍
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年1期

    王興吉 賈仁潔 王克芬 劉文龍

    摘要以本公司菌種保藏室的產(chǎn)脂肪酶黑曲霉菌株AG007作為出發(fā)菌株,通過常溫常壓等離子體(ARTP)誘變篩選得到突變株A45-72,其產(chǎn)脂肪酶的活力較AG007提高了86%。再對A45-72進行亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變,得到突變菌株GH-73,其搖瓶發(fā)酵酶活達到2 350 U/mL,較出發(fā)菌株AG007提高了1.2倍,將GH-73傳到第10代,其產(chǎn)酶較穩(wěn)定。搖瓶中添加2.5%橄欖油作為誘導(dǎo)劑時,產(chǎn)酶能力達到2 875 U/mL。通過酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn),其最適作用溫度為30 ℃,且在0 ℃左右保留30%的活性,是一種低溫脂肪酶。

    關(guān)鍵詞常溫常壓等離子體;亞硝基胍;復(fù)合誘變;低溫脂肪酶

    中圖分類號S-3文獻標(biāo)識碼A

    文章編號0517-6611(2019)01-0001-03

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.001

    開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

    脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是一類具有特殊酯鍵的水解酶[1],它能夠催化長鏈脂肪酸甘油酯的水解,也能夠催化該反應(yīng)的逆反應(yīng),除此之外,許多微生物分泌的脂肪酶還能夠催化酯交換反應(yīng)、酸解反應(yīng)、醇解反應(yīng)、氨解反應(yīng)和酯化反應(yīng)等[2-3]。

    微生物脂肪酶是指能夠分解或合成高級脂肪酸及丙三醇形成的甘油三酸酯酯鍵的酶。微生物脂肪酶種類較多,具有比動物脂肪酶更廣泛的溫度和pH作用范圍,便于工業(yè)化生產(chǎn)。目前,它是一種重要的工業(yè)用酶,主要應(yīng)用于食品風(fēng)味及香味的改進、油脂的水解、低等油脂的改性、皮革絹紡的脫脂、添加于化妝品及洗滌劑中等。特別是在有機合成工業(yè)及油脂化工行業(yè)中,酶催化的反應(yīng)具有耗能低、條件溫和及成品質(zhì)量高等優(yōu)點,具有巨大的應(yīng)用潛力。

    目前,工業(yè)上應(yīng)用的脂肪酶主要是高溫和中溫脂肪酶,酶的最適作用溫度一般在40 ℃左右或者更高,并且在0 ℃左右基本喪失活性[4-6]。低溫酶在較低溫度條件下仍然具有比較高的酶活,熱穩(wěn)定性下降[7],因而在食品、洗滌、環(huán)保等方面具有廣泛的應(yīng)用。另外,低溫脂肪酶還具有熱不穩(wěn)定性的特點,這對于某些工業(yè)性的生物催化來說是有益的,例如,在食品的加工過程中,能夠在溫度較低的條件下快速使酶失去活力,進而避免在酶的熱處理失活過程中對食品造成營養(yǎng)損失[8]。

    低溫脂肪酶是指最適反應(yīng)溫度在30 ℃左右,并且在0 ℃附近仍然具有一定催化活力的脂肪酶[9]?,F(xiàn)在低溫脂肪酶產(chǎn)生菌大多數(shù)來自南北兩極和大洋底部等長期處于低溫的環(huán)境中[10]。盡管產(chǎn)脂肪酶的微生物容易發(fā)現(xiàn),可是,尋找到適合工業(yè)生產(chǎn)的脂肪酶生產(chǎn)菌株及其發(fā)酵條件卻比較困難,而通過傳統(tǒng)的誘變篩選能很大程度上提高脂肪酶的產(chǎn)量,使許多脂肪酶實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。以本公司菌種室保藏的黑曲霉菌株AG007作為出發(fā)菌株,采用ARTP和亞硝基胍復(fù)合誘變的手段,獲得了一株遺傳穩(wěn)定性良好的高產(chǎn)脂肪酶菌株,并且對其酶學(xué)性質(zhì)進行初步研究。

    1材料與方法

    1.1材料試驗菌株,黑曲霉AG007,本公司菌種室保藏。

    1.2培養(yǎng)基

    1.2.1種子培養(yǎng)基。葡萄糖1.500%、玉米漿2.000%、硫酸銨0500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1.500%、氯化鈣0050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

    1.2.2富集培養(yǎng)基。葡萄糖1.500%、酪素水解物1.000%、橄欖油乳化液1.500%、硫酸銨0.500%、硫酸鎂0.100%、磷酸二氫鉀1500%、氯化鈣0.050%、氯化鈣0.600%、磷酸氫二鉀2.500%、硫酸亞鐵0.030%。

    1.2.3平板初篩培養(yǎng)基。

    牛肉膏0.300%、蔗糖1.000%、硫酸鎂0.030%、胰蛋白胨0.300%、磷酸二氫鉀0.100%、酵母膏0100%、橄欖油乳化液2.500%,0.100%去氧膽鈉。

    1.2.4斜面培養(yǎng)基。

    蔗糖3.000%、硝酸鈉0.200%、硫酸亞鐵0010%、硫酸鎂0.025%、磷酸氫二鉀0.100%、氯化鉀0050%、硫酸亞鐵0.001%、瓊脂1.300%。

    1.2.5搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基。玉米淀粉6.000%、玉米粉1500%、豆餅粉2.000%、蔗糖0.800%、麩皮2.000%、玉米漿1.600%、磷酸氫二鉀0200%、硫酸鎂0.250%、硫酸銨0300%、硝酸鈉0.800%、氯化鈣0020%、橄欖油2.000%。

    1.2.6Tris緩沖液(pH 7.0)。馬來酸2.500%、氫氧化鈉2000%、硫酸銨0.200%、硫酸鎂0.020%、二水氯化鈣0025%。

    1.3試驗方法

    1.3.1孢子懸液的制備。取一只新鮮培養(yǎng)的斜面,加入20 mL生理鹽水,用無菌鐵鏟將其表面的孢子刮下,并將其轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的三角瓶中,置于搖床上振蕩打散30 min,用無菌脫脂棉過濾,濾液于10 000 r/min離心5 min,棄上清,菌體用適量的生理鹽水重懸,調(diào)整孢子濃度在106~107[11]。

    1.3.2ARTP誘變。取10 μL制備好的孢子懸液均勻涂布于載片中央,用無菌鑷子將載片轉(zhuǎn)移至ARTP系統(tǒng)操作室旋轉(zhuǎn)臺上的對應(yīng)孔位上,將照射距離調(diào)整為2 mm,氣流量10SLM,功率100 W,然后設(shè)置不同的照射時間進行誘變[12]。

    1.3.3亞硝基胍誘變。

    1.3.3.1亞硝基胍(NTG)溶液的配制。

    在生物安全柜中稱取0.035 g亞硝基胍于15 mL無菌離心管中,加入10 mL Tris緩沖液,將離心管置于熱水中待亞硝基胍完全溶解,制成NTG母液。

    1.3.3.2誘變方法。

    在無菌三角瓶中分別按表1加入制備好的孢子懸液、NTG母液及Tris緩沖液(其中,0#為對照組,1#、2#和3#為試驗組)。然后將三角瓶于30 ℃條件下振蕩反應(yīng)30 min,反應(yīng)完畢后將三角瓶里面的液體轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中,10 000 r/min離心5 min,棄上清,加入45 mL Tris緩沖液重懸,10 000 r/min離心5 min后棄上清,再加入45 mL Tris緩沖液沖洗,反復(fù)沖洗3次,以除去殘留的NTG,最后加入5 mL Tris緩沖液和5 mL 50%甘油重懸菌體。

    1.3.4脂肪酶活力的測定方法。

    用聚乙烯醇橄欖油乳化液法測定[13],一個酶活定義為在測定條件下,每分鐘釋放1 μmol脂肪酸所需要的酶量。

    1.3.5篩選方法。

    1.3.5.1初篩方法。將誘變后的菌懸液接種到添加酪素水解物的富集培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min條件下富集培養(yǎng)2 h。將富集培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)涂布平板,30 ℃條件下培養(yǎng)3 d,觀察各個菌落周圍油脂水解圈的大小及菌落形態(tài),選取水解圈較大或菌落形態(tài)發(fā)生變化的菌株轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基中。

    1.3.5.2復(fù)篩方法。挑取斜面長好的菌種接入種子培養(yǎng)基中,30 ℃,200 r/min條件下培養(yǎng)3 d。將長好的種液按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶中,30 ℃,220 r/min條件下培養(yǎng)5 d。發(fā)酵結(jié)束時,將發(fā)酵液于10 000 r/min條件下離心5 min,取上清測定酶活。

    2結(jié)果與分析

    2.1ARTP誘變結(jié)果

    2.1.1ARTP誘變時間的確定。氣流量10SLM,功率100 W,將經(jīng)ARTP處理不同時間的孢子懸液進行適當(dāng)稀釋后涂布于篩選平板上,30 ℃條件下培養(yǎng)3 d,計算不同照射時間的致死率及正突變率,選擇合適的誘變時間。

    試驗結(jié)果表明,隨著誘變時間的延長,致死率逐漸增加,當(dāng)誘變時間為40 s時,致死率達到99%以上。通過計算正突變率發(fā)現(xiàn),當(dāng)誘變時間為30 s時,致死率達到86.7%,而正突變率為25%,此時繼續(xù)增加誘變時間正突變率隨之降低,所以試驗中將誘變時間選為30 s。

    2.1.2ARTP誘變篩選結(jié)果。

    經(jīng)過ARTP誘變,共篩選到10

    株酶活提高較大的突變菌株。搖瓶復(fù)篩結(jié)果表明,這10株正突變菌株遺傳性穩(wěn)定,其酶活提高比例及產(chǎn)孢子結(jié)果如表3所示。試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),該10株突變菌株產(chǎn)孢子的量比對照菌株都有不同程度地減少,其中突變菌株A45-72酶活提高了86%,產(chǎn)孢子量最少,所以將其選為下一步NTG復(fù)合誘變的出發(fā)菌株。

    2.2 NTG誘變結(jié)果

    2.2.1NTG誘變劑量的選擇。

    在誘變時間為30 min的條件下,不同NTG濃度下的致死率如表4所示。試驗結(jié)果可以看出,隨著NTG濃度的提高,致死率逐漸增加。通過計算正突變率發(fā)現(xiàn),隨著NTG濃度的增加,正突變率先上升后下降,當(dāng)NTG終濃度為25 μg/mL時正突變率最高,此時致死率為80.7%,繼續(xù)增加NTG濃度,正突變率會相應(yīng)的降低,所以試驗中選擇NTG終濃度為25 μg/mL。

    2.2.2NTG誘變篩選結(jié)果。通過NTG誘變篩選到一株酶活提高較大的突變株GH-73,該突變菌株的搖瓶發(fā)酵酶活達到2 350 U/mL,相對于原始菌株酶活提高了1.2倍。該菌株的生長速度比原始菌株要慢,不產(chǎn)孢子。

    2.3突變菌株遺傳穩(wěn)定性研究

    將突變菌株GH-73連續(xù)進行10代培養(yǎng),以測定其遺傳穩(wěn)定性,試驗結(jié)果如表5所示,該菌株10次傳代酶活均在2 200 U/mL以上,表明該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性較好。

    2.4誘導(dǎo)劑對菌株GH-73產(chǎn)酶的影響

    2.4.1油脂種類對菌株GH-73產(chǎn)酶的影響。某些微生物 只有在誘導(dǎo)物存在時才能產(chǎn)生脂肪酶[14],采用以上搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基,在培養(yǎng)基中添加不同種類2%油脂作為誘導(dǎo)劑,采用上述發(fā)酵方法測定酶活,結(jié)果如表6所示。可以看出,誘導(dǎo)劑為橄欖油時,誘變菌株GH-73搖瓶發(fā)酵酶活最高,酶活為2356 U/mL,表明以橄欖油作為誘導(dǎo)劑時該菌株產(chǎn)脂肪酶活力最高。

    2.4.2橄欖油的添加量對菌株GH-73產(chǎn)酶的影響。以橄欖油作為誘導(dǎo)劑,在上述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同用量,采用上述發(fā)酵方法測定酶活,結(jié)果如圖1所示??梢钥闯觯谝欢ǖ臐舛确秶鷥?nèi),隨著橄欖油添加量的增加,酶活隨之增加,當(dāng)添加量為2.5%時,產(chǎn)酶最高,酶活為2 875 U/mL。此時,再繼續(xù)增加橄欖油的添加量,菌株產(chǎn)脂肪酶的活力降低。所以,發(fā)酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。該試驗結(jié)果與Gupta 等[15]報道的結(jié)果相符,油脂濃度的添加量會影響菌株產(chǎn)脂肪酶的能力,隨著油脂濃度的升高,菌株產(chǎn)脂肪酶的活力相應(yīng)上升,但是當(dāng)油脂添加量過高時,又會抑制脂肪酶的生產(chǎn)。

    Fig.1Effect of different volumes of olive oil on lipase production by strain GH73

    2.5菌株GH-73酶學(xué)特性研究在0~50 ℃范圍內(nèi)測定同一酶液的脂肪酶活力,結(jié)果如圖2所示,該酶最適溫度為

    30 ℃,并且在0 ℃左右具有一定的催化活性。在0~30 ℃隨

    著溫度的升高酶活相應(yīng)上升,當(dāng)溫度超過40℃時,酶活迅速下降,表明該突變菌株產(chǎn)生的脂肪酶為低溫脂肪酶。

    3結(jié)論

    通過ARTP和NTG復(fù)合誘變,篩選出一株酶活提高1.2倍的高產(chǎn)菌株GH-73,該菌株不產(chǎn)孢子,生長速度相對于對照菌株有所變慢,搖瓶酶活力達到2 350 U/mL,10次傳代后酶活力維持在2 300 U/mL左右,遺傳穩(wěn)定性好。

    以橄欖油作為誘導(dǎo)劑時,該菌株產(chǎn)脂肪酶活力最高,并且在一定的濃度范圍內(nèi),隨著橄欖油添加量的增加,酶活增加,當(dāng)添加量為2.5%時產(chǎn)酶最高,酶活為2 875 U/mL。此時,再繼續(xù)增加橄欖油的添加量,菌株產(chǎn)脂肪酶的活力降低。所以,發(fā)酵搖瓶中橄欖油的最佳添加量為2.5%。

    對該菌株進行酶學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn),其最適作用溫度為30 ℃,且在0 ℃左右保留30%的活性,是一種低溫脂肪酶,因此,在食品、洗滌、醫(yī)藥和環(huán)保等領(lǐng)域有著良好的應(yīng)用前景。

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