ROS1融合基因突變在非小細(xì)胞肺癌診斷與治療中的研究進展*

江薇 綜述 王懿娜 審校

據(jù)研究統(tǒng)計，腫瘤居美國疾病死亡率第2位，美國癌癥協(xié)會預(yù)測2018年僅肺癌新發(fā)患者將達到23.5萬例，而死亡人數(shù)為15.5萬例［1］。其中，晚期非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最為常見的病理學(xué)類型，約占80%～85%［2］。對于腫瘤的治療手段，從傳統(tǒng)的放化療，發(fā)展到分子靶向治療、免疫治療及聯(lián)合治療等。在靶向治療中，EGFR突變、ALK重排、ROS1重排等基因的治療方式均已比較成熟。其中，約有1%～2%的非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者攜帶ROS1基因重排［2］。美國每年新增約2 000至4 500例ROS1融合基因陽性的NSCLC患者［3］。本文就ROS1融合基因陽性NSCLC的最新研究進展進行綜述。

1 ROS1融合基因的研究背景

ROS1 基因最初是于1986年在鳥肉瘤病毒（UR2）發(fā)現(xiàn)的具有獨特致癌作用的基因序列［4］，于2007年首次在NSCLC 中被發(fā)現(xiàn)［5］，除了肺癌，也在卵巢癌、胃癌、大腸癌等惡性腫瘤中檢測到ROS1 融合［6-8］。ROS1 屬于胰島素受體家族的一種單體型受體酪氨酸激酶。其在人類中的生物學(xué)作用尚未明確，仍然是一個“孤兒”受體酪氨酸激酶，尚未找到已知的配體［9］。人類的ROS1 基因定位于6q21 染色體［10］，屬于酪氨酸激酶胰島素受體基因，由胞內(nèi)酪氨酸激酶活性區(qū)、跨膜區(qū)及胞外區(qū)3 部分組成，編碼具有酪氨酸激酶活性的嵌合蛋白［11］。ROS1基因發(fā)生重排時丟失細(xì)胞外區(qū)域，保留跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)域，重排位點主要發(fā)生在ROS1 基因的32～36 外顯子。在NSCLC 中ROS1 基因主要與CD74、SLC34A發(fā)生融合［12］，并持續(xù)激活ROS1酪氨酸激酶區(qū)及下游JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK 等信號通路［9］，進而引起腫瘤的發(fā)生。

ROS1 重排的患者有以下幾個臨床特點：年齡偏?。ㄖ形荒挲g49.8 歲），女性，從未吸煙/輕吸煙者，亞裔，以及腺癌的組織病理學(xué)診斷［13］。一項回顧性分析表明ROS1重排的患者中位生存期（36.7個月）高于其他基因重排的腫瘤，如EGFR 突變和ALK 重排的NSCLC（分別為25.3個月和23.9個月）［14］。

2 ROS1融合基因的檢測方法研究進展

ALK的基因檢測主要通過4種不同的方法進行，分別是熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH），免疫組織化學(xué)法（immunohistochemistry，IHC），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR），及第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing，NGS）［15］。與ALK 相比，ROS1 融合還沒有正式被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)為輔助檢測方法。由于ROS1 和ALK 在其ATP 結(jié)合位點中共享＞80%的標(biāo)志序列［16］，因此通常借鑒ALK 的檢測方法進行ROS1 基因檢測。有臨床試驗顯示克唑替尼對以FISH陽性為篩查入組條件的患者有效，因此該方法被認(rèn)為是確定ROS1陽性的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于FISH 熒光信號的快速消減及價格昂貴限制了其廣泛應(yīng)用［17］。與FISH 相比，IHC 具有高效、快速及價格低廉等優(yōu)勢，其敏感性和特異性可達90%以上。但由于肺泡Ⅱ型肺細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，骨轉(zhuǎn)移灶中破骨細(xì)胞均能表達ROS1［18］，加上ROS1 的染色模式可能因ROS1 融合的細(xì)胞內(nèi)定位不同而有所不同［19］，因而IHC會出現(xiàn)一定比例的假陽性。RTPCR技術(shù)在實驗室中應(yīng)用更為廣泛，其敏感性和特異性均較好，但由于ROS1 已知有14 個融合基因，且要從FFPE小樣本中獲得高質(zhì)量RNA的難度較大［18］，所以臨床應(yīng)用較少。

NGS不僅可準(zhǔn)確檢測已知的基因，更能準(zhǔn)確檢測罕見突變及其他未知的變異。NGS 的另一優(yōu)點是可以經(jīng)血漿的基因分型獲取，并可重復(fù)檢驗，與單純組織活檢相比檢出率從20.5%提高至35.8%［20］，且方便實時檢測有無復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。但NGS價格較貴且需較長檢驗周期，不同檢測平臺又存在各自的檢驗標(biāo)準(zhǔn)，降低了其檢測的準(zhǔn)確性。

熒光條形碼標(biāo)記單分子檢測技術(shù)（nCounter platform，CP）是一種基于多重mRNA的檢測方法，相對于其他檢測手段，具有較高的特異性和靈敏度，且檢測快速、價格低廉［21］，可用于包括ROS1 在內(nèi)的多種基因檢測，3個工作日內(nèi)即可完成［22-23］（表1）。

表1 ROS1融合基因檢測方法優(yōu)缺點比較

3 ROS1抑制劑的研究進展

由于ALK和ROS1的激酶結(jié)構(gòu)域的相似性，研究者嘗試將ALK抑制劑應(yīng)用于ROS1重排患者的身上，結(jié)果表明除了艾樂替尼外，所有的ALK 抑制劑均能有效的控制ROS1融合患者的病情。

3.1 第一代ALK抑制劑—克唑替尼（crizotinib）

克唑替尼是一種針對ALK、MET及ROS1基因重排的酪氨酸激酶抑制劑。最初是作為MET抑制劑研發(fā)的［24］，其后被批準(zhǔn)用于ALK 融合患者的一線治療。由于ALK 和ROS1 在激酶結(jié)構(gòu)域有49%的氨基酸序列同源性，在三磷酸腺苷（ATP）結(jié)合位點上有77%的同源性，2014年Shaw 等［12］將ROS1 重排的NSCLC 患者納入臨床研究PROFILE 1001 的擴展隊列，共50例NSCLC患者入組，其中有3例達到完全緩解，總體反應(yīng)率（overall response rate，ORR）為72%，中位無疾病進展時間（median progression-free survival，mPFS）為19.2 個月?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，克唑替尼被FDA 和歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)治療晚期ROS1-重排的NSCLC［25］。在歐洲的一項回顧性研究中，納入32例符合條件的患者，ORR為80%，mPFS為9.1 個月［26］。OO-1201 是一項針對東亞ROS1 陽性晚期NSCLC患者的單臂Ⅱ期臨床試驗，入組的127例患者中，17 例完全緩解，ORR 為71.7%，mPFS 為15.9 個月［27］。目前還有多項Ⅱ期臨床試驗正在進行中。

克唑替尼相關(guān)不良反應(yīng)主要為腹瀉（56%）、惡心（55.3%）、嘔吐（43.9%）、便秘（37.1%）和疲勞（21.7%）。ALT 和AST 異常發(fā)生率也較高（21%），而間質(zhì)性肺炎發(fā)生率為2.4%［28］。

3.2 第二代ALK抑制劑-色瑞替尼（brigatinib）

色瑞替尼是一種針對ALK、ROS1 基因重排的靶向藥物。在韓國一項Ⅱ期臨床試驗中，共招募32 例ROS1 陽性的患者（平均接受過3 種其他方式的治療）。其中2例經(jīng)過克唑替尼治療的患者在服用藥物后未見明顯療效，說明色瑞替尼可能對克唑替尼耐藥患者無明顯療效。排除這2 例患者后，其他30 例患者的ORR為67%，疾病控制率（disease control rate，DCR）為87%，mPFS為19.3個月。研究中有8例腦轉(zhuǎn)移患者，顱內(nèi)ORR為25%，顱內(nèi)DCR為63%［29］。

在該Ⅱ期研究中，色瑞替尼相關(guān)不良反應(yīng)主要為腹瀉（78%）、惡心（59%）、厭食癥（56%）和嘔吐（53%）。與克唑替尼相比，不良反應(yīng)更明顯。但在ASCEND-8研究中，調(diào)整色瑞替尼的劑量750 mg/d至450 mg/d 后，15 個月無進展生存率升高，而不良反應(yīng)減低［30］。

3.3 第二代ALK 抑制劑—布加替尼（brigatinib-AP26113）

布加替尼是一種針對ALK、ROS1 基因重排的靶向藥物，同時也是EGFR 突變抑制劑［31］。2017年被FDA批準(zhǔn)用于ALK陽性NSCLC患者的二線治療。在體外，克唑替尼、色瑞替尼和布加替尼對Ba/F3 細(xì)胞的生長有明顯抑制作用，IC50分別是2.12 nmol/L，10.92 nmol/L和2.68 nmol/L［32］。

在一個關(guān)于ALK 陽性的Ⅲ期臨床試驗中，布加替尼相關(guān)不良反應(yīng)主要是胃腸道癥狀、血肌酸激酶水平升高和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平升高（＞25%）。布加替尼組有61%的患者發(fā)生了3～5 級的不良事件，與克唑替尼組相比高11%［33］。

3.4 第三代ALK抑制劑-勞拉替尼（lorlatinib-3922）

勞拉替尼是針對ALK和ROS1的第三代酪氨酸激酶抑制劑。勞拉替尼擁有較高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)穿透能力，在標(biāo)準(zhǔn)劑量為100 mg的患者中，勞拉替尼的腦脊液與血漿比值為61%～96%［34］。在一項開放標(biāo)簽，單臂Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中第一階段（NCT01970865）共納入ROS1陽性NSCLC患者12例，6例（50%）部分緩解（PR），2例（17%）病情穩(wěn)定（SD），ORR為50%，mPFS為7個月。值得關(guān)注的是，勞拉替尼的平均腦脊液濃度相當(dāng)于未結(jié)合血漿濃度的75%，在該臨床試驗中共5例患者有顱內(nèi)可測量病灶，3例有顱內(nèi)的客觀反應(yīng)（60%）包括2例先前克唑替尼治療無效的患者［35］。在該臨床試驗第二階段，共納入ROS1陽性NSCLC患者47例，結(jié)果尚未公布。另外，勞拉替尼對比克唑替尼一線治療NSCLC Ⅲ期研究CROWN（NTC03052608）正在進行中。

勞拉替尼安全性能較好，相關(guān)不良反應(yīng)主要是高膽固醇血癥（72%），高甘油三酯血癥（39%），水腫（39%）和周圍神經(jīng)病變（39%）［36］。

3.5 第四代ALK 抑制劑-洛普替尼（repotrectinib TPX-0005）

洛普替尼是新一代ROS1、TRK 和ALK 的酪氨酸激酶抑制劑。與臨床上現(xiàn)有的同類抑制劑相比，洛普替尼的分子量更小，因此可以更好地穿透血腦屏障。在細(xì)胞實驗中，與克唑替尼、恩曲替尼、色瑞替尼、布加替尼及卡博替尼相比，洛普替尼擁有對野生型ROS1 重排更強的活性，并且對產(chǎn)生G2032R 耐藥突變的細(xì)胞株上，洛普替尼和卡博替尼活性相近（1.3vs.0.2 nmol/L），明顯高于勞拉替尼（160.7 nmol/L），同樣對于D2033N突變，洛普替尼活性略低于卡博替尼（1.3vs.0.2 nmol/L），但強于勞拉替尼（3.3 nmol/L）［37］。目前，關(guān)于洛普替尼在有ALK/ROS1/NTRK1-3 重排的實體腫瘤作用的一項Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗（NCT-03093116）正在進行中。

洛普替尼的不良反應(yīng)目前尚不明確，有研究表明1例服用該藥物的患者耐受性較好，僅出現(xiàn)不良反應(yīng)（AE）1級的共濟失調(diào)、偏癱和惡心等不適，并經(jīng)藥物治療后有所緩解［37］。

3.6 卡博替尼（cabozantinib XL184）

卡博替尼是一種具有抗ROS1、MET、VEGFR 2、Axl和RET等的酪氨酸激酶抑制劑。除了肺癌，其在甲狀腺髓樣癌、晚期腎細(xì)胞癌和肝細(xì)胞均有一定療效［32］?？ú┨婺崾且吧蚏OS1 激酶的一種有效抑制劑。另外，在服用克唑替尼后產(chǎn)生L2026M 和G2032R 耐藥突變的患者中，卡博替尼也表現(xiàn)出較強的治療效果［38］。在一項臨床研究中，通過挑選攜帶G2032R耐藥基因表達CD74-ROS1的MGH047細(xì)胞，卡博替尼很好抑制該細(xì)胞生長［32］。目前，一項關(guān)于卡博替尼的針對RET/ROS1/NTRK融合或MET/Axl擴增第二階段的試驗正在進行中，以更加明確卡博替尼對ROS1重排的療效（NCT 01639508）［39］。

卡博替尼不良反應(yīng)較明顯，相關(guān)不良反應(yīng)達AE3/4 級的是疲勞（13%）、掌跖發(fā)紅（10%）、腹瀉（7%）、高血壓（7%）和乏力（5%）［40］。

3.7 恩曲替尼（entrectinib RXDX-101）

恩曲替尼是一種強效的小分子酪氨酸激酶抑制劑，可抑制ROS1、NTRK 和ALK 的致癌重排。截至2017年9月，32例未接觸過靶向治療的ROS1融合陽性肺癌患者入組Alka-372-001、STARTRK-1 和STARTRK-2 的臨床試驗，25 例患者有反應(yīng)，ORR 為78%，mPFS 29.6個月。除此之外，恩曲替尼表現(xiàn)出較強的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）活性，6 例顱腦轉(zhuǎn)移患者中有5例（ORR 83.3%）有治療反應(yīng)［41］。然而，恩曲替尼對最常見的ROS1 耐藥突變，包括守門突變L2026M，G2032R和D2033N突變，沒有顯示出活性［42］。

恩曲替尼不良反應(yīng)較輕，在該Ⅱ期臨床試驗中，相關(guān)不良反應(yīng)主要是疲勞（46%）、體位障礙（42%）、胸悶（29%）、惡心（28%）和肌萎縮（23%）。僅1 例患者在雙倍劑量下發(fā)生一起AE 4級的嗜酸粒細(xì)胞性心肌炎，停藥后恢復(fù)［43］。

3.8 DS-6051b

DS-6051b 是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可抑制ROS1、NTRK的致癌重排。在一項日本關(guān)于DS-6051b的Ⅰ期臨床試驗（NCT02675491），共招募15例ROS1 陽性的NSCLC 患者，其中12 例有可測量病灶，ORR為66.7%，DCR為100.0%。4例患者先前接受了克唑替尼治療，1 例PR，2 例SD，但由于樣本容量較小，不能充分說明DS-6051b 對克唑替尼耐藥的患者有明確的療效［44］。同時，美國目前也正在進行一項Ⅰ期臨床試驗（NCT 02279433）。

上述臨床試驗中，DS-6051b 相關(guān)不良反應(yīng)主要是肝酶升高（80%），腹瀉，惡心與便秘發(fā)生率也較高，但都是AE2級或以下［44］。

4 ROS1抑制劑的耐藥機制

靶向治療的發(fā)展對于腫瘤患者來說，降低了治療痛苦，提高了生存質(zhì)量，延長了生存時間。但是，在用藥一定時間后，耐藥基因的出現(xiàn)將導(dǎo)致靶向藥物失效，疾病進展。

4.1 克唑替尼（crizotinib）的耐藥機制

4.1.1 ALK 激酶抑制劑 獲得性耐藥是由多種機制引起如激酶區(qū)突變和基因拷貝數(shù)的擴增，以及旁路信號的激活［45］。參考ALK的機制，ROS1的激酶催化結(jié)構(gòu)域突變是對ROS1 重排NSCLC 最常見的耐藥機制（約占50%～60%）。在一項研究中，共收納39 例ROS1 重排患者，其中16 例患者進行耐藥檢測，耐藥突變率為62.5%（10/16）。ROS1 突變包括：G2032R（41%）、D2033N（6%）和S1986F（6%）［46］。G2032R 突變位于ATP 結(jié)合位點的前沿區(qū)域，類似于ALK 中的G1202R，該突變首次在1例ROS1重排NSCLC女性患者中被發(fā)現(xiàn)［47］。它的出現(xiàn)加速了細(xì)胞集落形成和侵襲的進程，并通過增加Twist 1（一種轉(zhuǎn)錄因子）［48］的表達而誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換［49］，其能增強腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而且還能使腫瘤細(xì)胞具有類似干細(xì)胞的能力［50］。D2033N 也是相同區(qū)域的突變，類似于ALK 中的D1203N，而D2033N 會導(dǎo)致ATP 結(jié)合鄰位殘基與克唑替尼發(fā)生相互作用，造成D2033和克唑替尼之間失去關(guān)鍵的靜電相互作用［51］。而S1986F是通過影響富甘氨酸環(huán)在α-C螺旋末端的位置來產(chǎn)生影響［52］。還有L2026M 和L1951R 等突變，產(chǎn)生耐藥機制尚不明確。

4.1.2 旁路通路激活 由于克唑替尼的使用，ROS1通路由于信號無法向下游傳導(dǎo)，腫瘤細(xì)胞即可激活其他致癌驅(qū)動程序及其信號通路來代替，即ROS1通路占優(yōu)勢的耐藥，而出現(xiàn)EGFR突變、KRAS突變、KIT擴增、ErbB、MET 擴增等其他通路［53］，目前該說法尚未明確，僅有幾例個案，亟待臨床去證實。

4.1.3 腫瘤的異質(zhì)性 NSCLC 是基因及細(xì)胞異質(zhì)性最強的腫瘤之一，其突變基因的多樣性及基因拷貝擴增數(shù)的不同致使患者對克唑替尼有不同的敏感性，而同一腫瘤的不同亞群對藥物的敏感程度也不盡相同，現(xiàn)今的基因檢測由于技術(shù)及標(biāo)本量的限制尚不足以完全測出腫瘤組織的全貌。

4.1.4 自噬現(xiàn)象的存在 自噬細(xì)胞是對功能失調(diào)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的降解，是一種代謝補償［54］。大量的研究表明，自噬既能促進細(xì)胞存活，亦能誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡。Han 等［55］發(fā)現(xiàn)EGFR 抑制劑可以在野生型EGFR 的耐藥NSCLC 中通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路提高自噬水平，而在耐藥細(xì)胞中加入自噬抑制劑后藥物的細(xì)胞毒性作用得到明顯增強?？诉蛱婺嵋簿哂写偈鼓[瘤細(xì)胞自噬作用發(fā)生的能力，當(dāng)克唑替尼和自噬抑制劑同時使用也可以增強腫瘤生長的抑制效果。因此，自噬作用可能導(dǎo)致克唑替尼耐藥的產(chǎn)生。

5 結(jié)語

隨腫瘤患病人數(shù)逐年增加，NCCN指南建議對已經(jīng)失去手術(shù)機會轉(zhuǎn)移的NSCLC 病例先行基因檢測，包括EGFR，ALK，ROS1 及KRAS 等基因。自首次報告NSCLC的ROS1重排已經(jīng)過去了十余年，雖然不斷有新藥研發(fā)，且正在進行眾多臨床試驗，但截至目前為止，克唑替尼仍是FDA 和EMA 批準(zhǔn)治療ROS1 重排NSCLC 患者的唯一藥物。關(guān)于如何選擇一線藥物，仍有較大爭議。一方面，在細(xì)胞實驗中，克唑替尼對于野生型的ROS1重排Ba/F3 cells活性顯著低于洛普替尼、卡博替尼和勞拉替尼［37］。同時，由于ROS1重排的患者OS 較長，疾病發(fā)展的進程中，易轉(zhuǎn)移至CNS，而勞拉替尼，洛普替尼和恩曲替尼由于分子量較小，入腦濃度較克唑替尼更高，能更好的控制CNS的轉(zhuǎn)移或者進展。另一方面，克唑替尼的耐藥機制相對其他藥物較明確，在患者耐藥后，可以根據(jù)情況選擇序貫藥物治療，但如一線就采用其他藥物，后續(xù)用藥的缺乏可能導(dǎo)致最終的OS低于一線使用克唑替尼的患者。所以，用藥究竟該如何選擇，期待更多的臨床試驗給予答案。

除研發(fā)更強效的ROS1抑制劑之外，是否可以在患者能耐受的情況下，進行靶向藥物與免疫治療聯(lián)合，在迄今最大的亞洲分析NSCLC 組中，發(fā)現(xiàn)14 例ROS1 重排患者，其中5 例（35.7%）提示PD-L1 高表達［56］。在一項PDL-1表達與癌基因驅(qū)動突變狀態(tài)的相關(guān)性研究中，共納入196 例NSCLC 患者，包括3 例ROS1重排陽性，其中2例PD-L1表達＞50%，另1例也有50%的表達［57］。2018年ASCO 會議上，一項納入527 例攜帶驅(qū)動基因變異并接受過免疫檢查點抑制劑治療的Ⅳ期NSCLC 患者回顧性多中心研究中，共有5 例ROS1 重排的患者，ORR 為20%。上述研究說明ROS1重排患者可能存在PD-L1高表達，靶向藥物與免疫治療聯(lián)合也許能夠取得一定的療效，期待相關(guān)臨床試驗的數(shù)據(jù)報道和更新。