血小板生成素抑制TGFβ1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究*

秦博宇 汪進(jìn)良 齊曉光 陶然 周鑫 吳濤

肺癌是世界上最為常見的惡性腫瘤之一，國家癌癥中心2015年發(fā)布數(shù)據(jù)表明，2006年至2011年間，中國肺癌5年患病率為130.2 萬例［1］。放射療法是肺癌綜合治療的重要組成部分，對于早期肺癌具有良好的治療效果。然而，高能射線在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，不可避免地對放射區(qū)域附近正常細(xì)胞和局部肺組織造成損傷。其中，急性放射性肺炎和放射性肺纖維化是肺癌大劑量放療后較為常見且危重的并發(fā)癥［2-4］。此外，包括靶向治療、免疫治療及常規(guī)化療在內(nèi)的各種肺癌治療手段都有可能造成間質(zhì)性肺炎及肺纖維化［5-7］。肺纖維化病因組成復(fù)雜，是眾多致纖維化因子、免疫細(xì)胞及肺實(shí)質(zhì)細(xì)胞相互影響作用的結(jié)果，其病理特點(diǎn)表現(xiàn)為早期彌漫性肺泡炎和后期肺成纖維細(xì)胞異常增殖及以膠原蛋白為主的胞外基質(zhì)過度合成積聚。目前對肺纖維化機(jī)制研究尚不明確，臨床也缺乏有效的治療方案［8］。

血小板生成素（thrombopoietin，TPO）作為一種主要由肝臟產(chǎn)生的糖蛋白，在巨核細(xì)胞分化及血小板產(chǎn)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用［9］。近年研究發(fā)現(xiàn)，TPO處理能夠通過抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善由輻射或化學(xué)試劑造成的組織器官損傷［10-12］。由于氧化應(yīng)激反應(yīng)在肺纖維化的進(jìn)展過程中扮演重要角色，提示TPO 可能具有緩解肺纖維化進(jìn)展的潛在作用。因此，本研究擬觀察TPO 處理對TGFβ1 誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，為進(jìn)一步探討TPO在肺纖維化治療中的應(yīng)用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人胚肺成纖維細(xì)胞HFL 源自中國人民解放軍總醫(yī)院腫瘤中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 F12K培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS緩沖液、含0.02%EDTA 的0.25%胰蛋白酶均購自美國GIBCO公司、重組人血小板生成素、重組人TGFβ1因子均購自美國Peprotech 公司、CCK8 試劑（日本同仁公司）、細(xì)胞總RNA 提取mini 試劑盒（中國天根生化公司）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TAKARA公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)預(yù)混試劑（日本TAKARA 公司）、兔抗人ColⅠ抗體（美國Proteintech 公司）、鼠抗人αSMA 抗體、兔抗人Ki-67 抗體（中國中杉金橋公司）、山羊血清、DAPI（中國博士德公司）、熒光二抗（中國中杉金橋公司），PCR引物（中國華大基因公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Baxter 公司）、超凈工作臺（北京半導(dǎo)體設(shè)備廠）、倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）、酶標(biāo)儀（上海雷勃公司）、熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀（美國BioRAD公司）、分光光度計(jì)（德國Eppendrof公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胚肺成纖維細(xì)胞HFL 培養(yǎng)于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL鏈霉素的F12K培養(yǎng)基中。待細(xì)胞生長至90%匯合，吸棄培養(yǎng)基用PBS 緩沖液潤洗一次，加入胰蛋白酶消化至細(xì)胞變圓脫落，加入培養(yǎng)基終止消化后將細(xì)胞收集至離心管內(nèi)，1 200 rpm 離心5min后將細(xì)胞重懸并接種至新培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.2 CCK8 法檢測TGFβ1 與TPO 處理對細(xì)胞增殖的影響 將HFL細(xì)胞消化為單細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，靜置培養(yǎng)24h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基并分別加入含不同細(xì)胞因子的培養(yǎng)基：正常組（F12K+2%FBS）、對照組（F12K+2%FBS+10 ng/ml TGFβ1）、實(shí)驗(yàn)組（F12K+2%FBS+10 ng/ml TGFβ1+100 ng/ml TPO），每組均設(shè)置5 個(gè)重復(fù)檢測孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄孔中培養(yǎng)基并加入含10%CCK8試劑的培養(yǎng)基，37℃孵育1 h后使用酶標(biāo)儀測定每孔OD值（測定波長450 nm）。細(xì)胞相對增殖率計(jì)算公式為：相對增殖率=（實(shí)驗(yàn)組/對照組OD）×100%。

1.2.3 細(xì)胞總RNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測將細(xì)胞消化后離心收集細(xì)胞團(tuán)，并按試劑盒使用分離獲得細(xì)胞總RNA。通過分光光度計(jì)檢測RNA純度及濃度后，將800 ng總RNA通過Prime Script RT Master Mix 及oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用SYBR Green摻入法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀采集熒光數(shù)據(jù)。GAPDH基因作為檢測基因表達(dá)的內(nèi)參對照。不同樣本間基因相對表達(dá)水平經(jīng)內(nèi)參表達(dá)均質(zhì)化后采用2-ΔΔCt法計(jì)算獲得。PCR 反應(yīng)引物如下：COL1A2-FP：GGCCCTCAAGGT TTCCAAGG；COL1A2-RP：CACCCTGTGGTCCAACA ACTC；cMPL- FP：CTGAAGTGTTTCTCCCGAACAT；cMPL-RP：GCGGGTAGGCATACAGCAG；GAPDH-FP：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT；GAPDH-RP：GGCT GTTGTCATACTTCTCATGG。

1.2.4 細(xì)胞免疫熒光染色 對細(xì)胞進(jìn)行不同處理后，吸棄培養(yǎng)基后加入4%多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞15 min。用含0.2%Triton×100的PBS緩沖液室溫處理細(xì)胞15 min。用含10%山羊血清的PBS緩沖液處理細(xì)胞1 h。用封閉液稀釋的一抗并孵育細(xì)胞過夜（4℃）。洗滌后用PBS稀釋的熒光二抗室溫避光孵育細(xì)胞1 h。洗滌后用PBS稀釋的DAPI孵育細(xì)胞5 min。洗滌后將細(xì)胞置于熒光顯微鏡下觀察染色情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以表示；計(jì)數(shù)資料采用Student'st檢驗(yàn)、多組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用ANOVA 方差分析。以P＜0.05 為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGFβ1誘導(dǎo)HFL細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化

本研究采用10 ng/mL TGFβ1處理誘導(dǎo)HFL細(xì)胞分化［13］。與對照組相比，經(jīng)10 ng/mL TGFβ1 處理24～48 h，HFL 細(xì)胞核質(zhì)比縮小，細(xì)胞形態(tài)逐步由短梭形或卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形（圖1A）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，經(jīng)TGFβ1 處理24～48 h 肺肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因α-SMA 與COL1A2表達(dá)水平均較對照組顯著提高（圖1B）。免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步顯示，經(jīng)TGFβ1 處理48h 后細(xì)胞αSMA 及COL1 蛋白的表達(dá)水平較對照組顯著提高（圖1C）。這些結(jié)果均表明TGFβ1處理能夠誘導(dǎo)HFL細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2.2 TPO抑制TGFβ1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變

為探討TPO 對肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響，首先應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR 對TGFβ1 處理前后TPO受體c-MPL基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。檢測結(jié)果顯示，該基因在TGFβ1 處理前后均在細(xì)胞中表達(dá)，提示TPO 能夠通過結(jié)合其受體發(fā)揮生物學(xué)作用（圖2A）。TGFβ1與TPO聯(lián)合處理HFL細(xì)胞24～48 h，顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)低濃度（10 ng/mL）或高濃度（100 ng/mL）的TPO 處理均未導(dǎo)致細(xì)胞凋亡水平的顯著提高（圖2B）。熒光實(shí)時(shí)定量PCR 檢測結(jié)果表明，TPO 與TGFβ1聯(lián)合處理HFL細(xì)胞24 h及48 h，肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志基因αSMA 及COL1A2 的表達(dá)水平均較對照組（單獨(dú)添加TGFβ1 組）顯著下降，且抑制效果與TPO處理濃度呈正相關(guān)（圖2C）。

圖1 TGFβ1誘導(dǎo)HFL細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化

圖2 TPO抑制TGFβ1介導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

2.3 TPO處理抑制TGFβ1介導(dǎo)的HFL細(xì)胞增殖

TGFβ1 能夠通過活化SMAD 信號通路促進(jìn)HFL細(xì)胞的異常增殖。在本研究中，將100 ng/mL TPO 與TGFβ1 聯(lián)合處理HFL 細(xì)胞24 h，CCK8 檢測結(jié)果表明TPO組細(xì)胞數(shù)量較對照組顯著降低（圖3）。提示TPO處理后能夠抑制TGFβ1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖發(fā)生。

圖3 TPO 抑制TGFβ1 介導(dǎo)的細(xì)胞過度增殖（CCK8 法檢測TGFβ1 和TPO聯(lián)合處理相較TGFβ1單獨(dú)處理后細(xì)胞增殖率變化）；**P＜0.01

2.4 TPO 能夠挽救TGFβ1 對HO-1 基因表達(dá)的抑制作用

血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）作為熱休克蛋白家族成員之一，是一種廣泛存在的抗氧化酶，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗增生效應(yīng)。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR 發(fā)現(xiàn)，TGFβ1 處理24h 后細(xì)胞HO-1 基因的表達(dá)水平較正常細(xì)胞顯著降低，而加入TPO 處理后，該基因的表達(dá)水平較TGFβ1組顯著提高，達(dá)到正常組細(xì)胞的水平（圖4）。

圖4 TPO 促進(jìn)HO-1 基因的表達(dá)（實(shí)時(shí)定量PCR 分析TGFβ1 聯(lián)合TPO處理后HO-1基因的相對表達(dá)水平；相對表達(dá)水平與未處理樣本比較，GAPDH為內(nèi)參基因）；*P＜0.05

3 討論

肺纖維化是臨床腫瘤治療過程中一類常見并發(fā)癥。臨床研究表明，目前應(yīng)用最為廣泛的腫瘤治療手段均可能導(dǎo)致間質(zhì)性肺炎及肺纖維化的發(fā)生，包括：1）大劑量放射線治療；2）博萊霉素、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、吉西他濱等化療藥物治療；3）吉非替尼、索拉菲尼、伊馬替尼等靶向藥物治療等。目前，對特發(fā)性肺纖維化的治療手段十分匱乏，臨床常用的激素治療效果有限且副作用大，難以逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展［8，14-15］。

大量研究表明，在免疫細(xì)胞及炎性因子的刺激下，肺臟局部組織產(chǎn)生TGFβ1，并通過激活SMAD 信號通路誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞的分化，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積。過量胞外基質(zhì)沉積會(huì)導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)異常及氣體交換功能下降，最終導(dǎo)致呼吸功能衰竭［8］。因此，抑制肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變、增殖及膠原蛋白合成成為延緩肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

TPO 作為一類臨床治療血小板減少癥及血小板減少性紫癜的常用藥物，已被大量研究證實(shí)不僅具有促進(jìn)巨核細(xì)胞增殖分化的作用，能夠使JAKSTAT、MAPK 等信號通路抑制胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，并通過抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)的作用。本研究中，利用TGFβ1 介導(dǎo)的HFL 細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變模型，發(fā)現(xiàn)TPO 受體c-MPL 基因在TGFβ1 處理前后均表達(dá)于HFL細(xì)胞中。經(jīng)TPO處理能夠顯著抑制COL1A2及αSMA基因及蛋白的表達(dá)水平及細(xì)胞的過度增殖。對TPO作用靶點(diǎn)的研究發(fā)現(xiàn)，TPO處理能夠顯著上調(diào)HO-1基因的表達(dá)水平，可能是TPO抑制膠原蛋白合成的潛在途徑之一。HO-1 已被證實(shí)在應(yīng)激條件下保持細(xì)胞的穩(wěn)定性發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用，并能夠通過調(diào)控NRF2 抑制內(nèi)源性ROS 的產(chǎn)生減少組織脂質(zhì)過氧化，發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷的功能［16-19］。放化療均可導(dǎo)致局部組織ROS的代謝失衡，是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵啟動(dòng)因素之一。因此，TPO是否通過HO-1 介導(dǎo)的ROS 抑制發(fā)揮其抗纖維化的功能，值得在后續(xù)的研究中進(jìn)行深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TPO 能夠作為一類新型的肺纖維化候選治療藥物，具有抑制細(xì)胞增殖及肌成纖維細(xì)胞膠原蛋白合成的雙重作用。為進(jìn)一步開展體內(nèi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供了一定的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。