微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應(yīng)用價值

蘇華 陳琛 蔣麗娜

[摘要] 目的 探討微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應(yīng)用價值。 方法 收集2015年7月～2018年5月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科膿毒癥患者152例作為研究對象，自然咳痰采集法收集痰液標(biāo)本99例，經(jīng)支氣管鏡抽吸法收集標(biāo)本53例，分別進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸檢測，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)是否分離到肺炎克雷伯菌分為肺炎克雷伯菌組42例和非肺炎克雷伯菌組110例。 結(jié)果 細(xì)菌培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌陽性率為27.6%（42/152），微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸檢測法陽性率為38.8%（59/152），后者陽性率高于前者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌組經(jīng)微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢出陽性菌37例，其中自然咳痰采集法檢出21例，支氣管鏡抽吸法檢出16例，非肺炎克雷伯菌組檢出陽性菌22例，其中自然咳痰法檢出15例，支氣管鏡抽吸法檢出7例，經(jīng)支氣管鏡抽吸法和自然咳痰采集法檢測的ROC曲線下面積為0.847和0.836，約登指數(shù)前者（0.694）高于后者（0.672）。與細(xì)菌培養(yǎng)法的一致性評價（Kappa值為0.604 > 0.600，P < 0.05）比較，兩種檢測方法有較高的一致性。 結(jié)論 微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中具有快速、靈敏的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法有較高的一致性，為臨床提供更好的的診療依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 微流控;環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增;膿毒癥;肺炎克雷伯菌

[中圖分類號] R563.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（a）-0144-05

[Abstract] Objective To explore the clinical value of microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection in the diagnosis of Klebsiella pneumoniae infection in sepsis patients. Methods From June 2015 to May 2018， 152 sepsis patients who were from the department of ICU of the First Affiliated Hospital of Hebei North University were collected， 99 cases of sputum specimens samples were collected by natural cough method， 53 cases were collected by bronchoscopy. All these samples were simultaneously detected by traditional pathogen culture method and microfluidic loop-mediated isothermal amplification method. According to the traditional bacterial culture result， all cases were divided into two group， 42 cases were Klebsiella pneumoniae infection group and 110 cases were non Klebsiella pneumoniae infection group. Results The positive rate of Klebsiella pneumoniae detected by bacterial culture was 27.6%（42/152）， and by microfluidic loop-mediated isothermal amplification detection was 38.8%（59/152）， which was higher than the former， the difference was statistically significant（P < 0.01）. The method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification detected 37 positive cases from Klebsiella pneumoniae infection group， including 21 cases natural cough sample and 16 cases bronchoscopy sample， Non Klebsiella pneumoniae infection group was detected by the method of microfluidics loop-mediated isothermal amplification had 22 cases positive samples，including 15 cases natural cough samples and 7 cases bronchoscopy samples. The area under the ROC curve of the bronchoscopy suction method and natural cough collection method was 0.836 and 0.847. The Jordan index of former （0.694） was higher than the latter （0.672）. The Kappa value was 0.604 > 0.600， P < 0.05， indicating a high consistency between the two methods. Conclusion Microfluidic loop-mediated isothermal amplification has the advantages of rapid and sensitive detection of Klebsiella pneumoniae in sepsis patients， which is highly consistent with the traditional bacterial culture method and can provide better clinical diagnosis and treatment basis.

[Key words] Microfluidics; Loop-mediated isothermal amplification; Sepsis; Klebsiella pneumoniae

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，Kp）是一種常見的革蘭陰性機(jī)會致病菌，是引起醫(yī)院感染的常見致病菌之一，由于其耐藥性呈逐年升高趨勢，成為導(dǎo)致患者死亡的重要原因，尤其是重癥醫(yī)學(xué)科的膿毒癥患者，微流控（microfluidics）環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）集成診斷技術(shù)是一種新興的分子診斷技術(shù)[1]，目前主要用于病原微生物的快速核酸檢測[2-3]，它將微流控的微型化、多通道、易檢測、造價低廉等優(yōu)點與LAMP技術(shù)的高靈敏度、簡便、耗時短等優(yōu)點[4]相結(jié)合，集成了一個新型的診斷技術(shù)。本研究探討了微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法在膿毒癥患者肺炎克雷伯菌檢測中的應(yīng)用價值，旨在為臨床醫(yī)生提供更好的診療依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）2015年7月～2018年5月重癥醫(yī)學(xué)科膿毒癥患者作為研究對象，收集患者基本臨床資料：年齡、性別、住院天數(shù)，膿毒癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1991年美國胸科醫(yī)師學(xué)會和危重病醫(yī)學(xué)會（ACCP/SCCM）制訂的標(biāo)準(zhǔn)。采集患者的痰液標(biāo)本152例，其中男87例，女65例，平均年齡（68.2±15.3）歲，平均住院時間（12.5±3.2）d，其中自然咳痰法收集痰液標(biāo)本99例，經(jīng)支氣管鏡抽吸法收集痰液標(biāo)本53例，根據(jù)細(xì)菌培養(yǎng)是否分離到肺炎克雷伯菌分為肺炎克雷伯菌組42例和非肺炎克雷伯菌組110例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得家屬知情同意。

1.2 肺炎克雷伯菌培養(yǎng)鑒定

嚴(yán)格按照微生物痰液標(biāo)本的采集及送檢標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本采集，采用PHOEN XTMl00全自動細(xì)菌分析儀對菌落進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.3 肺炎克雷伯菌核酸檢測

1.3.1 呼吸道病原菌核酸檢測? 試劑盒（圖1）購于北京博奧生物集團(tuán)有限公司。本試劑盒采用微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)，利用兩對特異性引物，在65℃恒溫下，快速完成DNA擴(kuò)增。加入核酸反應(yīng)產(chǎn)物檢測的熒光染料進(jìn)行恒溫實時熒光分析。

1.3.2 痰液提取方法? 標(biāo)本采集與處理：患者須在抗菌素治療前采集痰標(biāo)本。①自然咳痰法：清晨第一口痰液為宜，勿混入唾液或鼻咽分泌物，②經(jīng)支氣管鏡抽吸：纖維支氣管鏡對肺段和亞段進(jìn)行灌洗，采集肺泡表面襯液，一般不少于5 mL，分別送檢細(xì)菌培養(yǎng)及微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸檢測。用于環(huán)介導(dǎo)等溫檢測的標(biāo)本白細(xì)胞數(shù)>25個/低倍視野，上皮細(xì)胞<10個/低倍視野。

1.3.3 樣本檢測? 痰液液化：痰標(biāo)本轉(zhuǎn)移到密封容器，加入等體積的10% NaOH，渦旋混勻器震蕩混勻，37℃，液化30 min。核酸標(biāo)本制備：取1 mL液化的樣品至1.5 mL離心管，4℃，離心半徑8 cm，12 000 r/min，離心5 min，棄上清，加洗滌液混勻離心后棄上清，加入100 μL核酸提取液，混勻后轉(zhuǎn)移到核酸提取管，用核酸快速提取儀提取核酸，4℃，離心半徑8 cm，10 000 r/min，離心1～3 min備用。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系：在標(biāo)本制備區(qū)加入34.5 μL待測核酸樣品，20 μL LAMP擴(kuò)增反應(yīng)試劑，擴(kuò)增反應(yīng)總體系為54.5 μL。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)：50 μL反應(yīng)體系移入加樣口，反應(yīng)：37℃，3 min;65℃，47 min。LAMP擴(kuò)增檢測結(jié)果判斷：產(chǎn)物擴(kuò)增曲線呈S形，快速擴(kuò)增出現(xiàn)第一個峰值拐點時所對應(yīng)的時間與原點時間差值為擴(kuò)增熒光指數(shù)增加時間（Tp值），計算得到待檢物的陽性預(yù)測值，最低檢測限為5×102拷貝/反應(yīng)。擴(kuò)增肺炎克雷伯菌陽性標(biāo)本的熒光歸一化曲線，見圖2，陽性內(nèi)對照為人源標(biāo)本的內(nèi)質(zhì)控，陽性外對照為無核酸模板的實驗質(zhì)控。

圖2? ?微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢測肺炎克雷伯菌陽性

熒光歸一化曲線

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用百分率表示，兩種方法肺炎克雷伯菌檢出率間的比較采用配對資料的χ2檢驗。計算環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法及其不同標(biāo)本類型檢測方法的靈敏度、特異度、漏診率、誤診率、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比，評價方法采用ROC曲線，計算曲線下面積和約登指數(shù)。實驗評價與一致性分析采用Kappa檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌檢出情況

細(xì)菌培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌陽性率為27.6%（42/152），微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸檢測法陽性率為38.8%（59/152），后者陽性率高于前者，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）。肺炎克雷伯菌組經(jīng)微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法檢出陽性菌37例，其中自然咳痰采集法21例，經(jīng)支氣管鏡抽吸法16例，非肺炎克雷伯菌組檢出陽性菌22例，其中自然咳痰采集法15例，經(jīng)支氣管鏡抽吸法7例。見表1。

表1? ?不同標(biāo)本類型微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測結(jié)果（例）

2.2 兩種方法檢測肺炎克雷伯菌方法性能評價

以細(xì)菌培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法的靈敏度、特異度、漏診率、誤診率、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然比分別為88.1%、80.0%、11.9%、20.0%、82.2%、62.7%、94.6%、4.4、0.15，ROC曲線見圖3，曲線下面積0.840，約登指數(shù)0.681。經(jīng)支氣管鏡抽吸法和自然咳痰采集法檢測的評價見表2，ROC曲線見圖4（A、B）。

2.3 兩種方法的一致性分析

兩種方法的一致性分析評價Kappa值為0.604 > 0.600（P < 0.05），提示兩種檢測方法有較高的一致性。見表3。

3 討論

肺炎克雷伯菌是呼吸道感染的常見致病菌，是引起醫(yī)院感染的條件致病菌，可引起局部暴發(fā)流行。微流控技術(shù)結(jié)合了微電子、理化等技術(shù)，實現(xiàn)分子診斷技術(shù)中復(fù)雜分析過程的微型化、集成化、連續(xù)化檢測，可實現(xiàn)生物分子快速、大信息量的檢測[5-8]。微流控裝置搭載傳統(tǒng)PCR技術(shù)存在許多局限，如需手工微量移液操作[9];設(shè)計安裝微型閥和電極[10]增加設(shè)備研發(fā)成本;依賴昂貴的檢測儀器等[11]。LAMP技術(shù)能在等溫條件下實現(xiàn)一步擴(kuò)增，由于針對靶基因設(shè)計了兩對特異引物，反應(yīng)的靈敏度和特異性大大提升[12]。LAMP的這些優(yōu)點規(guī)避了微流控技術(shù)的使用局限，而微流控技術(shù)也為LAMP核酸檢測系統(tǒng)提供了微量密閉反應(yīng)空間，也使病原微生物床旁檢測（POCT）逐漸成為可能[13]。

本研究顯示微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增陽性率、靈敏度及特異性均較高，分別為38.8%、88.1%及80.0%、這與李松等[14]的研究結(jié)果相近。本研究中微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢出17例肺炎克雷伯菌培養(yǎng)陰性患者，說明存在痰培養(yǎng)陽性率低的可能，近一步的探討發(fā)現(xiàn)這些患者中有12例患者都曾接受過抗生素治療且治療效果明顯，分析原因可能是抗生素治療后細(xì)菌培養(yǎng)陽性率降低，影響了細(xì)菌培養(yǎng)鑒定的陽性率，而核酸檢測方法并未受影響，這與錢婧等[15]的研究一致。本研究所用的試劑盒最低檢測限為5×102拷貝/反應(yīng)，檢出的陽性率為38.8%，高于傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)鑒定方法的27.6%，具有一定的優(yōu)勢，二者的臨床符合率較高（Kappa值0.604 > 0.600）。本研究對經(jīng)支氣管鏡抽吸和自然咳痰法收集標(biāo)本的檢測性能進(jìn)行了比較，約登指數(shù)前者（0.694）高于后者（0.672），說明經(jīng)支氣管鏡抽吸法獲取的臨床標(biāo)本優(yōu)于自然咳痰采集法。有研究[16]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)比較，微流控環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增法更容易檢測到混合菌株，原因可能為細(xì)菌培養(yǎng)鑒定中可挑選出優(yōu)勢菌的單菌落進(jìn)行鑒定，而核酸檢測的方法卻不能，因此對于核酸檢測的結(jié)果解釋仍應(yīng)該結(jié)合患者情況具體分析。

近年來，隨著微流控環(huán)介導(dǎo)技術(shù)的不斷發(fā)展進(jìn)步，各種便攜檢測設(shè)備也孕育而生，如手機(jī)等電子設(shè)備的加入將實現(xiàn)數(shù)據(jù)的實時傳輸和儲存[17]。微流控環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增集成診斷技術(shù)將使高質(zhì)量、低成本的前沿診斷技術(shù)實現(xiàn)基層醫(yī)院的推廣，廣泛應(yīng)用于醫(yī)、教、研領(lǐng)域[18-19]，如疾病監(jiān)測和管理、病原體鑒定、醫(yī)源性感染的控制、環(huán)境監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)查及遺傳病的檢測等[20]，為推動醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展帶來新動力。

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（收稿日期：2018-09-30? 本文編輯：封? ?華）