耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的IMP—4耐藥基因LAMP檢測

鄭雅卿+李鴻茹+黃珊珊+毛文平+陳愉生

【摘要】 目的：分析耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌的臨床一般情況的特點(diǎn)，檢測IMP-4耐藥基因分布情況。方法：搜集2014年11月-2016年4月福建省立醫(yī)院微生物室從不同病區(qū)各種臨床標(biāo)本分離的肺炎克雷伯菌280株，其中包括耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌38株。根據(jù)對碳青酶烯類抗生素的敏感性，選擇38株耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）設(shè)為試驗(yàn)組，隨機(jī)選擇28株非耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌（KP）為對照組進(jìn)行MP-4基因的LAMP技術(shù)檢測，產(chǎn)物電泳觀察結(jié)果。結(jié)果：耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌多見于老年有抗生素使用史的患者，LAMP法檢測出CRKP組38株細(xì)菌中23例含IMP-4基因，KP組28株細(xì)菌中2例含IMP-4基因，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：本研究建立的IMP-4 基因LAMP檢測方法有助于初步判斷肺炎克雷伯菌是否為耐藥株。

【關(guān)鍵詞】 肺炎克雷伯菌； 耐碳青霉烯酶； LAMP

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.13.004 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1674-6805（2017）13-0008-04

【Abstract】 Objective：To analyze the clinical characteristics of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae， and to detect the distribution of IMP-4 resistance gene.Method：A total of 280 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from various clinical specimens of the Fujian Province Hospital from November 2014 to April 2016，including the carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae strains of.According to the sensitivity of carbapenem antibiotics，38 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（CRKP） for the experimental group， randomly selected 28 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（KP） for the matched group.MP-4 gene LAMP technology products the results of electrophoresis.Result：Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae was more common in elderly patients with a history of antibiotic use，LAMP detected a CRKP group of 38 strains of bacteria in 23 cases with IMP-4 gene，KP group of 28 strains of bacteria in 2 cases with IMP-4 gene，the differences were statistically significant （P<0.05）.Conclusion：The IMP-4 gene LAMP detection method established in this study can help to determine whether Klebsiella pneumoniae is a resistant strain.

【Key words】 Klebsiella pneumoniae； Carbapenem resistant； LAMP

First-authors address： Provincial Clinical Medical College of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350000，China

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）屬腸桿菌科，存在于上呼吸道和腸道中，是常見的人體條件致病菌，當(dāng)機(jī)體抵抗力減弱時，該菌可引起肺部、泌尿系感染，甚至敗血癥。近年來，肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染逐年增高，已成為醫(yī)院感染的重要致病菌[1]。碳青霉烯類抗生素自問世以來，就成為多重耐藥性肺炎克雷伯菌的主要治療藥物，能有效殺滅病原菌。但是肺炎克雷伯菌在臨床抗生素廣泛使用甚至濫用的選擇壓力下，特別是第三代頭孢菌素、碳青霉烯類藥物的大量應(yīng)用，耐藥形勢日趨嚴(yán)重，出現(xiàn)了對碳青霉烯類藥物耐藥的肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP），并且耐藥率逐年遞增，給臨床治療帶來極大困難[2]。2015年，全國耐藥監(jiān)測網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，肺炎克雷伯菌對第三代頭孢菌素的耐藥率全國為36.5%，耐碳青霉烯類耐藥率為7.6%[3]。面對如此嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥形勢發(fā)展，加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測、減少抗生素濫用導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥變得十分重要。

本研究針對肺炎克雷伯對碳青霉烯的耐藥情況和耐藥基因測定進(jìn)行研究，尋找可以快速判斷細(xì)菌耐藥性的基因指標(biāo)，指導(dǎo)臨床抗生素使用。

1 資料與方法

1.1 菌株來源

搜集2014年11月-2016年4月筆者所在醫(yī)院微生物室從不同病區(qū)各種臨床標(biāo)本培養(yǎng)出的肺炎克雷伯菌280株，標(biāo)本類型包括：血液、痰、尿液、傷口分泌物、導(dǎo)管末端、肺泡灌洗液、膽汁、鼻腔分泌物、穿刺液、肝膿腫引流液、腹水、胸水等。標(biāo)本2 h內(nèi)送檢，采用常規(guī)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，鑒定細(xì)菌，所有菌株均應(yīng)用法國生物梅里埃公司的VlTEK2-compact全自動細(xì)菌分析儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏分析，測定最低抑菌濃度（MIC），質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603。對符合標(biāo)準(zhǔn)的菌株采用紙片法和細(xì)菌保存液保存法各保存菌株一份于-70℃冰箱中，所有標(biāo)本均采用統(tǒng)一形式編號，以建立肺炎克雷伯菌標(biāo)本庫。

1.2 判定及排除標(biāo)準(zhǔn)

（1）耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）2016年版標(biāo)準(zhǔn)（CLSIM100-S26）[4]，厄他培南≤18 mm、亞胺培南和美羅培南的抑菌圈直徑≤19 mm判斷為耐藥或VITEK-2藥敏顯示這三種抗生素中介/耐藥，需進(jìn)行手工法確認(rèn)。美羅培南、亞胺培南或厄他培南三者中，至少對其中之一耐藥的菌株為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：剔除重復(fù)標(biāo)本。

1.3 主要儀器與試劑

DNA核酸提取試劑盒（博奧生物公司）；LAMP引物合成（上海生工生物工程有限公司）；BstDNA聚合酶（北京百奧萊博科技有限公司）；VlTEK2-compact全自動細(xì)菌分析儀（法國生物梅里埃公司）。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌DNA的提?。úＡе榉ǎ?采用博奧生物公司細(xì)菌核酸提取試劑盒提取。

1.4.2 引物設(shè)計 引物設(shè)計根據(jù)Genebank公布的基因序列，用PrimerExplorer4.0引物設(shè)計軟件進(jìn)行目標(biāo)序列引物設(shè)計，獲取一套特異性IMP-4基因的LAMP引物，包括1對內(nèi)引物和1對外引物，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4.3 LAMP擴(kuò)增方法與步驟 配制25 μl的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系組成包括：反應(yīng)緩沖液2.5 μl，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μl，dNTP mixture（10 mmol/L）3.5 μl，F(xiàn)IP/BIP（40 μmol/L）1.0 μl，F(xiàn)3/B3（5μmol/L）1.0 μl，Bst DNA Polymerase（8000 U/ml）10 μl，DNA模板2.0 μl，HBN（4 mmol/L）0.75 μl，加超純水ddH2O至25 μl，65 ℃水浴恒溫反應(yīng)60 min。

1.4.4 LAMP產(chǎn)物測定 瓊脂凝膠電泳法測定LAMP產(chǎn)物，在凝膠成像儀中觀察或拍照記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

2014年11月-2016年4月筆者所在醫(yī)院微生物室搜集到肺炎克雷伯菌280株，標(biāo)本來源主要為痰、尿、血，還包括其他如膿液、穿刺液、導(dǎo)管末端、肺泡灌洗液、鼻腔分泌物、腹水、胸水、膽汁等。細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏鑒定結(jié)果提示有耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）38株，耐藥率為15.7%。臨床資料提示CRKP組38例，男26例，女12例，年齡28～97歲，平均（74.76±16.96）歲；65歲以上患者31例，占81.58%；標(biāo)本來源主要為痰和尿液，感染多為入院48 h以上發(fā)生，占63.58%；31.58%患者在送檢標(biāo)本前有使用過抗生素治療。非耐藥菌組242例，男173例，女69例，年齡0～96歲，平均（60.54±20.61）歲 ；65歲以上患者133例，占54.96%；標(biāo)本來源主要為痰和血液，感染多為入院48 h以上發(fā)生，占70.25%；15.29%患者在送檢表本前有使用過抗生素治療，見表2 。

2.2 IMP-4耐藥基因的LAMP檢測結(jié)果：

利用LAMP技術(shù)對38株耐碳青酶烯類肺炎克雷伯菌（CRKP組）和從非耐藥菌中隨機(jī)挑選的28株肺炎克雷伯菌（KP組）進(jìn)行IMP-4基因檢測，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳判定，CRKP組38株菌株中檢測出23株陽性，KP組28株菌株中檢出2株陽性，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖1、圖2、表3。

3 討論

肺炎克雷伯菌對碳青酶烯類抗生素耐藥率逐年上升，臨床分離到的耐藥菌往往出現(xiàn)在危重患者身上。在傳統(tǒng)病原學(xué)檢測報告出具之前，臨床醫(yī)生僅能采取經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素。如何避免傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏結(jié)果報告滯后的缺點(diǎn)，尋找可以很好提示細(xì)菌耐藥性的臨床特點(diǎn)和基因型檢測指標(biāo)是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法（Loop-mediated Isothcrmal Amplifieation，LAMP）屬于恒溫擴(kuò)增法中的一種，2000年由日本科學(xué)家Notomi等[5]提出，可以體外擴(kuò)增并檢測目標(biāo)基因。反應(yīng)原理是DNA遵循嚴(yán)格的堿基配對，所以針對目的基因的6個序列區(qū)域設(shè)計4條特異性引物（2條內(nèi)引物、2條外引物）來檢測目的基因的存在與否。本研究通過設(shè)計了一套特異性IMP-4基因的LAMP引物，測定我院肺炎克雷伯菌的IMP-4基因分布情況。包括細(xì)菌DNA提取、LAMP反應(yīng)體系、LAMP反應(yīng)產(chǎn)物凝膠電泳分析獲得結(jié)果，整個過程僅需2 h左右。相比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)藥敏結(jié)果2～3 d出具結(jié)果，有明顯的優(yōu)勢，并且進(jìn)行LAMP反應(yīng)不需要對致病菌進(jìn)行增菌養(yǎng)殖，在反應(yīng)第一步就殺滅了致病菌，提取出DNA，生物安全更有保障；相比PCR方法，LAMP不需要專門的核酸擴(kuò)增儀器，反應(yīng)過程恒溫，減少了PCR升溫、降溫過程對DNA的損耗，而LAMP與PCR一樣，遵循嚴(yán)格的堿基配對，對檢驗(yàn)標(biāo)本可以不提純致病菌而直接處理提取DNA進(jìn)行檢測，其特異性和敏感度都得到多個試驗(yàn)的驗(yàn)證[6-7]，在敏感度方面甚至優(yōu)于PCR。但是LAMP反應(yīng)檢測的DNA片段不宜過長，一般在500 bp以下，反應(yīng)產(chǎn)物不能進(jìn)一步測序分析是它的劣勢。

CRKP組與非耐藥組在年齡和抗生素使用上的區(qū)別有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示耐藥菌株可能與患者的年齡、抗生素使用史有關(guān)，與文獻(xiàn)[8]報道一致。在患者性別、標(biāo)本類型等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。分析患者年齡大，機(jī)體免疫力差，且多合有其他基礎(chǔ)疾病，多次醫(yī)院就診的概率高，可能導(dǎo)致CRKP感染率高。抗生素使用若不能選擇敏感的抗生素，無法有效殺滅致病菌，反而容易導(dǎo)致耐藥株的出現(xiàn)，肺炎克雷伯菌可以通過整合子傳遞耐藥基因、外排泵上調(diào)、細(xì)胞膜改變等方式，產(chǎn)生耐藥性[9]。所以在臨床感染性疾病治療方案中，若能在用藥前，及早得到細(xì)菌藥物敏感性報告，對于合理選擇有效的抗菌藥物、避免耐藥菌產(chǎn)生有重要意義。