龍膽苦苷對(duì)人上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的影響及機(jī)制

高天勤，李欣，董圣軍，程春雷，史榮軍，賈龍，王健，劉寶輝

(1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東濱州256603；2濱州市人民醫(yī)院；3山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院；4陽(yáng)信縣人民醫(yī)院)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，病死率居?jì)D科惡性腫瘤的首位[1]?；熓悄壳爸委熉殉舶┑闹饕桨福殉舶?duì)化療藥物的耐藥及癌細(xì)胞較強(qiáng)的遷移能力是治療中急需解決的難題。近年來(lái)，傳統(tǒng)中藥因來(lái)源廣泛、不良反應(yīng)少、應(yīng)用安全及缺乏耐藥性等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越到關(guān)注。龍膽苦苷(GPS)是龍膽科龍膽屬植物龍膽的主要有效成分，大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷不僅有抗炎止痛[2]、保肝利膽[3]的作用，還具有拮抗腫瘤的作用[4]。但GPS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移等的作用及機(jī)制尚未有報(bào)道。2018年1～5月，我們觀察了GPS對(duì)人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖、凋亡及遷移能力的影響，并探討其機(jī)制，為GPS抗卵巢癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料及儀器 人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞由濱州醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)買于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；鼠源抗鼠凋亡蛋白B細(xì)胞白血病淋巴瘤相關(guān)蛋白(Bax)、P38絲裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)、p-P38 MAPK、B淋巴細(xì)胞/白血病-2(Bcl-2)抗體及β-actin均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔或鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)×100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒、組織裂解蛋白提取液、蛋白酶抑制劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotech公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；電泳、濕轉(zhuǎn)移槽及Western blotting發(fā)光照相系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Rio-Red公司。

1.2 細(xì)胞分組及干預(yù) 人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞用10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁融合。加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化并輕輕吹打?qū)⒁奄N壁的細(xì)胞，直至鏡下觀察細(xì)胞收縮至變圓，加入培養(yǎng)液以終止胰蛋白酶的作用。將脫落分離下的細(xì)胞吹打均勻后按1×108/L接種于培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中。待細(xì)胞融合后，換用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h，使細(xì)胞同步化后將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、GPS低劑量組、GPS中劑量組、GPS高劑量組。對(duì)照組單純加入0.01% DMSO培養(yǎng)48 h；GPS低、中、高劑量組分別在加入10、20與40 μmol/L GPS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，GPS用DMSO預(yù)溶，并用MEM培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。

1.3 各組細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。待細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，沖洗后加入DMEM培養(yǎng)液(100 μL)和含0.5%MTT的培養(yǎng)液(10 μL)，37 ℃無(wú)菌CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，再次棄培養(yǎng)液，并加入100 μL的DMSO原液，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀計(jì)于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)值，并重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次。增殖抑制率=[(對(duì)照組OD值-各組實(shí)驗(yàn)組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)]×100%。

1.4 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用TUNEL實(shí)驗(yàn)。各組細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛固定1 h后，根據(jù)該實(shí)驗(yàn)試劑盒所述的雙重染色法，TUNEL檢測(cè)液可沾染到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，鏡下呈綠色，DAPI可沾染到所有凋亡和未凋亡的細(xì)胞核，鏡下呈藍(lán)色。每組細(xì)胞隨即在熒光顯微鏡下選擇5個(gè)視野并觀察計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞/所有細(xì)胞×100%。

1.5 各組細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)步驟依據(jù)參考文獻(xiàn)[5]。將混勻的血管內(nèi)皮細(xì)胞以5×105/mL均勻種于6孔板內(nèi)，并鋪滿整個(gè)孔板。各組給予上述相應(yīng)處理后，以P200移液器槍頭垂至于6孔板劃出三條平行的“損傷”。用PBS洗細(xì)胞3次，去處劃下的細(xì)胞，加入5%胎牛血清培養(yǎng)基后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h。運(yùn)用倒置相差顯微鏡對(duì)遷移的各組細(xì)胞進(jìn)行拍照，并計(jì)算出劃痕上下界限之間距離的平均值。對(duì)照組設(shè)定為100%，計(jì)算細(xì)胞遷移率。

1.6 各組細(xì)胞內(nèi)p-P38 MAPK、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)p-P38 MAPK、促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。待細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，充分沖洗后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解物，對(duì)各組蛋白總量進(jìn)定量。取20 μL總蛋白在1×十二烷基硫酸鈉(SDS)緩沖液中煮沸8 min。當(dāng)?shù)鞍壮浞肿冃猿浞趾?，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)并電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜用含50 g/L脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。然后依次滴加p-P38 MAPK、P38 MAPK、Bax、Bcl-2和β-actin抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃過(guò)夜后TBST洗滌3次，每次10 min，然后用1∶5 000的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-羊抗兔或鼠IgG孵育2 h，然后用TBST洗滌3次，最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)進(jìn)行照相并用其附帶的軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。對(duì)照組設(shè)置為100%。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及遷移率比較 與對(duì)照組相比，GPS中劑量組、GPS高劑量組細(xì)胞增殖抑制率、遷移率均降低，凋亡率均升高(P<0.05或0.01)；且GPS高劑量組細(xì)胞增殖抑制率、遷移率均低于GPS中劑量組，凋亡率高于GPS中劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率及遷移率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GPS中劑量組比較，#P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2及p-P38 MAPK蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，GPS中劑量組、GPS高劑量組細(xì)胞內(nèi)Bax、p-P38 MAPK表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.05或0.01)，且GPS高劑量組細(xì)胞內(nèi)Bax、p-P38 MAPK表達(dá)均高于GPS中劑量組，Bcl-2表達(dá)低于GPS中劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞Bax、Bcl-2及p-P38 MAPK表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與GPS中劑量組比較，#P<0.05。

3 討論

卵巢癌因其起病隱匿，缺乏早期診療指標(biāo)，易早期出現(xiàn)浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及等原因，病死率位居?jì)D科惡性腫瘤首位[1, 6]。雖然目前對(duì)卵巢癌的診療取得了一定的進(jìn)展，但患者的5年病死率仍在25%～30%[7]。目前臨床上用于治療卵巢癌的藥物不良反應(yīng)大，且易產(chǎn)生耐藥性[8]。因此，尋找新的對(duì)卵巢癌細(xì)胞敏感、且具有更少不良反應(yīng)及耐藥性的藥物，是降低卵巢癌患者病死率、改善預(yù)后的關(guān)鍵。

GPS屬于裂環(huán)環(huán)烯醚萜苷類化合物，是龍膽屬植物的主要藥效成分之一。除了有抗炎止痛[2]、保肝利膽[3]、保護(hù)心肌[9]等作用外，在最近的研究發(fā)現(xiàn)，從龍膽中分離獲得的乙醇提取物具有抑制小鼠肉瘤、早幼粒細(xì)胞性白細(xì)胞及肺癌等多種腫瘤細(xì)胞的增殖作用[4,10]。趙忠偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，GPS能夠肝癌細(xì)胞的增殖，其具體機(jī)制為使肝癌細(xì)胞的G0/G1細(xì)胞增多，改變肝癌細(xì)胞的周期，同時(shí)可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。但GPS對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移的影響尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GPS中劑量組、GPS高劑量組細(xì)胞增殖抑制率、遷移率均降低，凋亡率均升高，提示GPS可抑制人上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖及遷移，并促進(jìn)其凋亡；GPS高劑量組細(xì)胞增殖抑制率、遷移率均低于GPS中劑量組，凋亡率高于GPS中劑量組，提示GPS較高時(shí)作用更明顯。

P38 MAPK是細(xì)胞內(nèi)MAPK之一，P38 MAPK信號(hào)通路在許多腫瘤組織中呈持續(xù)激活狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞中P38 MAPK可影響到下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白等效應(yīng)分子的活性[12]。P38 MAPK激活的性質(zhì)決定P38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)還是抑制細(xì)胞凋亡[13]。例如P38 MAPK可通過(guò)改變Bcl-2的構(gòu)象使其抗凋亡活性降低，從而抑制Bax/Bcl-2二聚體的形成，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，GPS中劑量組、GPS高劑量組細(xì)胞內(nèi)p-P38 MAPK表達(dá)上調(diào)，且GPS高劑量組細(xì)胞內(nèi)p-P38 MAPK表達(dá)高于GPS中劑量組，提示GPS可抑制人上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖及遷移，并促進(jìn)其凋亡的作用可能與激活P38 MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制Bax/Bcl-2等相關(guān)細(xì)胞凋亡途徑而實(shí)現(xiàn)。

Bax是一種線粒體蛋白，位于細(xì)胞的胞質(zhì)當(dāng)中，通常以單體形式存在，當(dāng)細(xì)胞過(guò)氧化損傷時(shí)Bax可以與線粒體膜相互結(jié)合形成復(fù)合體，促使凋亡因子從線粒體中釋放出來(lái)，從而啟動(dòng)凋亡，加重組織損傷。Bcl-2屬于一種抗凋亡蛋白，可以抑制凋亡因子的釋放，從而減少超氧陰離子。同時(shí)Bcl-2還可以與Bax聚合，抑制Bcl-2從而抑制細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，與對(duì)照組相比，GPS中劑量組、GPS高劑量組細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)下調(diào)，表明GPS可能通過(guò)Bax/Bcl-2信號(hào)通絡(luò)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上，GPS具有抑制人上皮性卵巢HO8910細(xì)胞增殖、遷移并促進(jìn)其凋亡的作用，其作用機(jī)制可能通過(guò)P38 MAPK信號(hào)通路，進(jìn)而上調(diào)凋亡蛋白Bax、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2，誘導(dǎo)HO8910細(xì)胞凋亡。但具體的作用機(jī)制需應(yīng)用P38 MAPK信號(hào)通路特異性抑制劑SB203580干預(yù)進(jìn)一步證實(shí)。