豬圓環(huán)病毒3型Taq Man-MGB熒光定量PCR方法的建立及應(yīng)用

李曉菲，陳 婷，孫愛榮，葛曉杰，黃 艷，徐 婷，王彩宏，魏笑笑，秦立廷

(山東新希望六和集團有限公司，山東 青島 266000)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，也是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動物病毒[1-2]。2016年之前PCV僅有兩個血清型，即PCV1和PCV2[3-4]。2016年美國報導(dǎo)出現(xiàn)一種新的圓環(huán)病毒血清型-PCV3，該病毒能引起豬的皮炎腎病綜合征、繁殖障礙及心臟和多系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)[5]。目前PCV3病毒尚未分離成功，致病性也未進行深入研究。2016年至2017年，我國已有13個省份(安徽、福建、河北、河南、山東、廣東、湖北、湖南、江蘇、江西、遼寧、沈陽和浙江)和一個直轄市(重慶)的豬場相繼檢測到 PCV3的存在[5]。目前，PCV3在我國豬群中的發(fā)病情況及流行情況并不清楚。因此建立一種快速、準確的PCV3實驗室診斷方法對于進一步了解PCV3在我國豬群中的流行情況具有重要意義。本研究建立一種可以快速、準確地檢測PCV3的TaqMan-MGB熒光定量PCR方法，為PCV3的流行病學(xué)調(diào)查以及檢測診斷PCV3提供準確、可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 病毒、臨床樣品與主要試劑 豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬輪狀病毒(RV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)、豬偽狂病病毒(PRV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)等病毒基因組均由新希望六和動保中心青島中心實驗室制備保存。47份疑似PCV3感染病料(包括血清、棉拭子和腸道等組織樣品)，由新希望六和動保中心青島中心實驗室在山東、河北等地的養(yǎng)豬場采集；PCV3陽性樣品為本實驗室鑒定并保存。DNA/RNA核酸共提試劑盒購自Invitrogen公司；DNA Marker和RNase-free water購自 TaKaRa公司；2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒均購自AxyGen公司。

1.2 引物探針設(shè)計與合成 參照GeneBank中PCV3病毒株基因序列(KT869077)進行比對分析，根據(jù)其保守區(qū)域設(shè)計特異性引物(QPCV3-F/R)和Taq-Man-MGB熒光探針(PCV3-Probe)(表1)，探針5'端標記FAM，3'端標記MGB。引物和探針均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.3 重組質(zhì)粒標準品制備 用Invitrogen核酸提取試劑盒提取PCV3陽性臨床樣品的DNA，以其為模板，利用引物QPCV3-F/R擴增目的基因，將PCV3目的片段經(jīng)回收純化后克隆至pMD19-T，將鑒定為陽性的質(zhì)粒進行濃度檢測，換算成拷貝數(shù)，以其作為質(zhì)粒標準品，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物探針序列信息Table 1 Primers and probe sequences information

1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標準曲線的建立 通過溫度梯度PCR在不同退火溫度下(52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃和65℃)進行熒光定量反應(yīng)以確定引物的最適退火溫度，采用矩陣法對探針濃度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L)和引物濃度(1.25μmol/L、2.5μmol/L、5.0μmol/L、10.0μmol/L、20.0μmol/L)進行優(yōu)化，最終獲得最適合的探針引物濃度配比，確定反應(yīng)體系。將1.3中制備的標準品10倍倍比稀釋(10-1～10-9)，利用優(yōu)化后的條件對稀釋后的標準品進行熒光定量PCR反應(yīng)，以獲得標準曲線。

1.5 特異性試驗 利用建立的熒光定量PCR方法對本實驗室保存的CSFV、PEDV、TGEV、RV和PRRSV的cDNA以及 PCV3、PPV、PRV和 PCV2的DNA進行PCR擴增，以驗證該方法的特異性。同時設(shè)無模板為陰性對照，PCV3陽性DNA為陽性對照。

1.6 敏感性試驗 將PCV3標準品質(zhì)粒連續(xù)10倍倍比稀釋后為模板，利用本實驗室前期建立的常規(guī)PCR方法[6]和本研究建立的熒光定量PCR檢測。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后觀察結(jié)果，比較兩種檢測方法的敏感性。

1.7 重復(fù)性試驗 利用該熒光定量檢測方法對5個稀釋度的質(zhì)粒模板進行檢測，每種濃度的模板重復(fù)檢測4次，根據(jù)Ct值計算批次內(nèi)變異系數(shù)；同時以這些質(zhì)粒為模板，在4個不同的時間進行批間重復(fù)性試驗，根據(jù)Ct值計算批次間變異系數(shù)，驗證該檢測方法的重復(fù)性。

1.8 對臨床樣品的檢測 對收集的疑似PCV3感染的臨床樣品，利用本實驗建立的熒光定量PCR檢測和常規(guī)PCR[6]分別進行檢測，比較分析結(jié)果。

同時對檢測出PCV3陽性的樣品進行其它豬病病原(CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV、RV和PCV2)的檢測[7-10]，分析混合感染情況。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果 優(yōu)化后的熒光定量PCR反應(yīng)體系為 25μL：12.5μL 2×Premix ExTaq(Probe qPCR)， 10 μL RNase-free water， 0.5 μL Probe(10 μmol/L)，0.5 μL Primer F(10 μmol/L)，0.5 μL Primer R(10μmol/L)，1μL質(zhì)粒標準品。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；94℃ 15 s、60℃ 45 s，40個循環(huán)。

2.2 熒光定量PCR標準曲線的建立 測定質(zhì)粒標準品濃度，換算拷貝數(shù)為4.78×1010拷貝/μL，然后對其進行10倍連續(xù)倍比稀釋，對4.78×101～4.78×109拷貝/μL的質(zhì)粒標準品進行熒光定量PCR反應(yīng)，獲得標準曲線(圖1)，結(jié)果顯示標準曲線線性關(guān)系良好，表明建立的該方法可用于臨床樣品的檢測。

圖1 PCV3熒光定量PCR標準曲線Fig.1 The standard curve of PCV3 real time PCR

2.3 特異性試驗 利用所建立的熒光定量PCR方法對 CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV、RV、PPV、PRV和PCV2等病毒的cDNA或者DNA進行特異性檢測，結(jié)果顯示，其對PCV3的檢測結(jié)果為陽性，其它病原及陰性對照均為陰性(圖2)，該方法與其它豬病病毒無交叉反應(yīng)，表明該方法具有良好的特異性。

2.4 敏感性試驗 利用常規(guī)PCR方法[6]和熒光定量PCR方法對倍比稀釋的標準質(zhì)粒進行檢測，結(jié)果顯示兩種方法檢測最低限分別為4.78×103拷貝/μL(圖3A)和 4.78×101拷貝 /μL(圖 3B)，PCV3 熒光定量方法比常規(guī)PCR方法敏感100倍。表明本研究建立的方法敏感性較高。

圖2 PCV3熒光定量PCR特異性試驗Fig.2 The specificity test of the PCV3 real time PCR

圖3 PCV3常規(guī)PCR敏感性試驗Fig.3 The sensitivity test of the PCV3 conventional PCR

2.5 重復(fù)性試驗 用5種濃度的質(zhì)粒標準品(4.78×107拷貝 /μL～4.78×101拷貝 /μL)分別進行批次內(nèi)和批次間的重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間重復(fù)性實驗的變異系數(shù)均小于2.3%(表2)，表明該方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

2.6 臨床樣品檢測結(jié)果 分別利用建立的熒光定量PCR和常規(guī)PCR方法對47份臨床樣品進行檢測，結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法陽性檢出率為21.3%，常規(guī)PCR方法為14.9%(表3)。表明熒光定量方法具有更高的敏感性，更適用于PCV3的臨床檢測，尤其是感染早期病毒含量較低時可用于臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查。

47份可疑臨床樣品中檢測到10份PCV3陽性樣品，對這10份樣品進行其它豬病病原檢測，結(jié)果顯示，10份PCV3陽性樣品均為混合感染：其中PRRSV和PCV3共感染10份；PRRSV，PCV2和PCV3共感染4份；PRRSV，PEDV和PCV3共感染2份。表明臨床上PCV3多與其它疾病混合感染，應(yīng)給予高度重視。

表2 PCV3熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果Table 2 The reproducibility test of the PCV3 real time PCR

表3 臨床樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection of clinical samples by the PCV3 real time PCR

3 討論

目前，針對PCV3的研究進展較少。為了進一步了解PCV3在我國豬群中的發(fā)病及流行情況，本研究根據(jù)GenBank中PCV3基因序列設(shè)計引物和探針，建立了一種特異性檢測PCV3的TaqMan-MGB熒光定量方法。該方法的建立為PCV3的實驗室診斷及流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、準確的檢測手段。

徐朋麗等建立了一種PCV3常規(guī)PCR檢測方法，敏感性良好，最低可以檢測62個拷貝數(shù)的模板DNA[11]。Chen等建立了一種基于SYBR的PCV3熒光定量方法，最低可以檢測173個拷貝數(shù)的模板DNA[12]。TaqMan熒光定量PCR方法相對于常規(guī)PCR和SYBR熒光定量PCR具有更高的特異性和敏感性，同時能夠減少假陽性結(jié)果。Wang等建立了一種TaqMan熒光定量PCR方法用于PCV3檢測，該方法最低可以檢測到100個拷貝數(shù)的模板，擴增效率為95.7%[13]。而本研究所建立的TaqMan PCV3熒光定量檢測方法相對于上述檢測方法具有更高的敏感性，最低可以檢測47個拷貝數(shù)的模板DNA，擴增效率接近100%，更適用于PCV3感染早期的病原檢測。

應(yīng)用本實驗建立的檢測方法對本實驗室2017年收集的47份可疑臨床樣品的檢測結(jié)果顯示，PCV3陽性樣品數(shù)為10份，陽性檢出率約為21.3%。Li等研究中發(fā)現(xiàn)PCV3/PRRSV混合感染率為62.5%，PCV3/PCV2混合感染率為45.8%[14]。因此，本研究進一步分析檢測到的10份PCV3陽性樣品的混合感染情況，發(fā)現(xiàn)10份PCV3陽性樣品均為混合感染，其 中 PRRSV/PCV3、PRRSV/PCV2/PCV3、PRRSV/PEDV/PCV3的混合感染率分別為100%、40%和20%。本研究中10份PCV3陽性樣品均同時存在PRRSV的感染，PRRSV感染與PCV3感染之間有是否某種聯(lián)系還需進一步研究。Palinski等從具有PDNS癥狀的母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)均檢測到PCV3病原，間接證實該病毒可以垂直傳播[6]。利用本研究所建立的PCV3熒光定量檢測方法，在新生腹瀉仔豬腸道中檢測到PCV3核酸的存在，進一步證實了PCV3垂直傳播的可能性。另外，Ku等利用PCR方法從豬精液中檢測到PCV3核酸，揭示該病毒也可以通過精液傳播[15]。

目前，針對PCV3的研究尚處于起步階段，PCV3病毒尚未分離成功，PCV3單獨感染以及與其它病原共感染的致病力均有待于進一步研究。本研究所建立的PCV3TaqMan-MGB熒光定量檢測方法，為PCV3的快速檢測及其流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、簡便和可靠的技術(shù)工具。