產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素蛋白抗原表位預(yù)測及CPB-N蛋白免疫原性分析

王玉建，商紅旗，朱 琳，徐煜琳，胡莉萍，朱瑞良*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院/山東省動物生物技術(shù)與疫病防治重點實驗室，山東 泰安 271018；2.山東省動物疫病預(yù)防與控制中心，山東 濟南 250022)

產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是由B型產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.perfringenstype B，CPB)和 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CPC)產(chǎn)生的一種強毒素，具有細胞毒性和強致死性，是引起人和動物壞死性腸炎以及動物痢疾的主要致病因子[1-2]。β毒素引起的嚴重疾病已經(jīng)得到證實[3-4]，研究β毒素在致病過程中激活淋巴細胞的免疫應(yīng)答過程，需要探索及確定其抗原結(jié)合部位。產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素蛋白完整序列含336個氨基酸，蛋白分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且完整的β毒素蛋白帶有原始毒性，而決定抗原免疫活性的只是整個蛋白分子中部分抗原區(qū)域，即抗原表位[5]。重組基因的研究表明，有效的基因片段可以在受體菌中表達，并被特異性抗體識別表現(xiàn)出良好的免疫原性[6]。在之前研究的基礎(chǔ)上[7-8]，本研究采用多種生物信息學手段，通過預(yù)測β毒素蛋白抗原表位，并結(jié)合對三維空間模型的分析，截取一段優(yōu)勢蛋白序列，并對該序列進行表達，將表達的新蛋白(CPB-N)與原始β毒素蛋白免疫原性進行比較，確認CPB-N與原始β毒素蛋白免疫原性的相似性，為后續(xù)融合蛋白的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 預(yù)測所用產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素蛋白序列源自GenBank(KP064408.1)；通過預(yù)測分析得到的CPB-N基因序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司全基因合成；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞購自北京康為世紀生物科技有限公司；重組質(zhì)粒pET28a-CPB-N由上海生工生物工程技術(shù)股份有限公司構(gòu)建；表達β毒素蛋白的BL21-β菌株和β毒素單克隆抗體(MAb)由本實驗室提供；HRP標記的山羊抗鼠IgG(IgG-HRP)和IgAHRP購自康為世紀生物科技有限公司；60只6周齡SPF BALB/c小鼠，購自濟南賽恩斯科技有限公司。

1.2 β毒素蛋白抗原表位預(yù)測 采用DNAStar Lasergene軟件對β毒素蛋白二級結(jié)構(gòu)、親水性、可塑性、抗原性進行預(yù)測[9]；應(yīng)用G+LPP模式對β毒素蛋白信號肽及切割位點進行預(yù)測；SWISS-MODEL建立β毒素蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)模型；ElliPro在線服務(wù)器以5個連續(xù)殘基為最低標準預(yù)測線性和不連續(xù)的抗原表位[10]；PyMOL軟件標記β毒素蛋白優(yōu)勢抗原表位，篩選、截取并建立CPB-N三維空間結(jié)構(gòu)模型。

1.3 CPB-N蛋白表達與鑒定 重組質(zhì)粒pET28a-CPB-N經(jīng)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21，篩選出陽性克隆子在含有Amp的LB肉湯中37℃、220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD600nm=0.5～0.6)，IPTG(終濃度1 ng/m L)誘導表達3 h，終止后菌液離心取沉淀，煮沸裂解后進行SDS-PAGE檢測。以小鼠抗β毒素MAb(1∶2 000)為一抗，山羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，進行western blot鑒定。

1.4 小鼠免疫及樣品采集 分3組進行小鼠免疫實驗，A組小鼠口服免疫1 m L 1010cfu/m L的pET28a-CPB-N/BL21重組菌液，B組小鼠口服免疫同劑量的BL21-β菌液，C組小鼠口服免疫相同劑量的PBS液。連續(xù)3 d進行重復(fù)免疫，并于首免后第14 d、15 d、16 d、28 d、29 d和30 d加強免疫。

各組分別在首免后的第0、7 d、14 d、21 d、28 d和35 d取3只小鼠從尾靜脈采血分離血清，迫殺實驗鼠后取腸段，用0.5 m L含有蛋白酶抑制劑的冰冷無菌PBS洗滌，收集腸道灌洗液。

1.5 特異性抗體測定 為鑒定CPB-N蛋白是否具有誘導系統(tǒng)性和粘膜抗體應(yīng)答的能力，參照文獻[11]ELISA方法，分別以預(yù)處理的小鼠血清和腸道灌洗液作為一抗，1∶4 000稀釋的山羊抗鼠 IgAHRP/IgG-HRP為二抗，檢測樣本血清中和腸道灌洗液中的IgG和IgA特異性抗體。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差(X±SD)表示。使用SPSS軟件(IBM)測定ANOVA的統(tǒng)計顯著性，其中*：p＜0.05為具有顯著性差異，**：p＜0.01為具有極顯著的差異。

2 結(jié)果

2.1 β毒素蛋白抗原表位預(yù)測 β毒素蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示aa200～aa320區(qū)段富含無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，易于接觸；aa30～aa300區(qū)段為親水性區(qū)域且可塑性較高；aa5～aa27區(qū)段為跨膜區(qū)，疏水性較強；ElliPro在線預(yù)測連續(xù)性與非連續(xù)性抗原表位主要集中在aa108～aa301區(qū)段。綜合預(yù)測β毒素蛋白有效抗原表位主要在aa108～aa320區(qū)段。

2.2 β毒素蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及CPB-N蛋白篩選PyMOL編輯蛋白三維結(jié)構(gòu)(圖1)：A顯示在β毒素蛋白優(yōu)勢抗原表位部分(紅色)；B-1標記aa265位Cys替換為His，B-2標記CPB-N蛋白截取位置；C顯示CPB-N獨立的結(jié)構(gòu)模型。綜合上述預(yù)測β毒素蛋白抗原表位的各項信息以及對β毒素蛋白三維結(jié)構(gòu)的分析，最終選取aa108～aa305區(qū)段且用His替代Cys-265作為有效呈遞β毒素蛋白抗原的新蛋白CPB-N。

圖1 β毒素蛋白三維結(jié)構(gòu)模型Fig.1 The three-dimensional structuremodel of beta toxin protein

2.3 CPB-N蛋白的表達及鑒定 重組菌pET-32a-CPB-N/BL21經(jīng)IPTG誘導后進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示誘導表達的蛋白約為24 ku(圖2A)，與預(yù)期新蛋白CPB-N大小相符。利用His標簽抗體進行western blot檢測結(jié)果顯示在約24 ku處有一條特異性條帶，且亮度與β毒素蛋白的條帶亮度相近(圖2B)，表明CPB-N在BL21中表達效果較好。

圖2 CPB-N蛋白的SDS-PAGE檢測(A)及western blot鑒定(B)Fig.2 The detection and identification of CPB-N protein by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.4 CPB-N蛋白與β毒素蛋白免疫原性比較 分別通過ELISA檢測免疫小鼠特異性IgG和IgA抗體，結(jié)果顯示，在口服免疫之前，3組小鼠之間的IgG和lgA水平無差異(p＞0.05)。第一次加強免疫后，A和B組中抗β毒素特異性IgG和lgA的水平明顯升高，兩者之間差異不大(p＞0.05)，C組檢測不到特異性抗體。在首免后第21 d、28 d和35 d觀察到A組和B組抗體差異明顯縮小，大致處于相同水平(p＞0.05)，表明CPB-N與β毒素蛋白具有相似的免疫原性。

圖3 免疫小鼠血清中l(wèi)gG(A)及腸道灌洗液中l(wèi)gA抗體(B)水平Fig.3 The antibody levels of lgG in serum(A)and lgA in intestinal lavage fluid(B)

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌β毒素是一種毒力較強的成孔毒素，由336aa編碼組成，對胰蛋白酶敏感，具有溶細胞活性，同時能夠增大毛細血管滲透性、增加血壓、降低心率，是一種非典型性的神經(jīng)毒素[12-13]。近年來已經(jīng)確認β毒素分為兩種，傳統(tǒng)β毒素名為β1毒素，新型β毒素名為β2毒素，β1毒素仍然是造成各種疾病的主要致病因子[14]，因此本研究預(yù)測的抗原表位也是針對傳統(tǒng)β1毒素。抗原表位是決定蛋白抗原特異性的一段特殊化學基因，也是與相應(yīng)的淋巴細胞表面的抗原受體特異性結(jié)合的部位，因此了解β毒素蛋白的抗原表位，一方面有助于為β毒素致病機制的研究提供思路，另一方面，可以針對性的做好β毒素的免疫預(yù)防工作。

實驗證明CPB的C-末端殘基(CPB256-276)與來自金黃色葡萄球菌的α毒素的C-末端部分(SAA245-267)極為相似。CPB256-276可能是整個β毒素蛋白序列中負責與細胞受體結(jié)合的區(qū)域，而N-末端未有特殊功能區(qū)域。與其它毒素一樣(如肉毒桿菌神經(jīng)毒素)，受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常含有保護性表位的主要部分。同時，265位半胱氨酸殘基被酪氨酸或組氨酸置換能夠?qū)е露舅氐闹滤阑钚詥适Ф旧砩飳W活性不變[15]。結(jié)合抗原表位和β毒素蛋白三維空間構(gòu)型預(yù)測的結(jié)果，aa108與aa305恰好位于β-折疊與無規(guī)則卷曲交界處，此區(qū)間包括線性抗原表位和aa108～aa301的非線性表位在內(nèi)的所有有效氨基酸(包括CPB256-276)，且具有良好的空間構(gòu)型(利于抗原-抗體結(jié)合)。與多表位多肽相比，CPB-N蛋白異源表達產(chǎn)物表現(xiàn)出優(yōu)秀的生物學活性，而多表位多肽表達產(chǎn)物空間構(gòu)型尚不可知，并且某些功能未知的多肽容易被忽略，最終表達產(chǎn)物表現(xiàn)出的免疫原性可能與原始β毒素蛋白有差別。

本實驗通過替換或去除β毒素蛋白無效區(qū)域，消除β毒素蛋白所具有的天然毒性且縮短氨基酸序列，保證了蛋白本身的生物活性。通過對CPB-N和β毒素蛋白免疫后小鼠的抗體滴度測定，已經(jīng)確定CPB-N能夠發(fā)揮與β毒素蛋白相似的免疫原性，而其本身分子量相對較小并且無毒性，也為抗原表位作為疫苗的候選物提供了檢測依據(jù)。本研究對CPB-N蛋白進行篩選是希望探尋一種將多種小蛋白融合以達到綜合免疫的效果，單一小蛋白(CPB-N)的免疫原性已經(jīng)得到證明，與其他抗原融合的最終效果仍需要進一步探究。因此，通過對β毒素蛋白抗原表位的預(yù)測，篩選出分子量更小的CPB-N蛋白，對融合蛋白的有效構(gòu)建極為重要，也為產(chǎn)氣莢膜梭菌進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。