重組腐敗梭菌α毒素的制備與免疫效力評(píng)價(jià)

彭國(guó)瑞，彭小兵，李旭妮，董令贏，蔣玉文

(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

快疫(Braxy)是羊的一種多發(fā)、非接觸、急性和致死性傳染病，其病原腐敗梭菌(Clostridium septium)可以產(chǎn)生α、β、γ和δ4種外毒素[1-2]，其中α毒素是該病主要的致死性毒力因子和免疫保護(hù)性抗原[3-4]。因快疫發(fā)病急，往往來不及治療即發(fā)生死亡，因此免疫接種是預(yù)防該病最有效的途徑之一，我國(guó)主要采用羊快疫、黑疫二聯(lián)滅活疫苗；羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗及羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗等預(yù)防，然而這幾種疫苗的檢驗(yàn)合格率并不高[5]，存在免疫效果不確實(shí)的問題。美國(guó)和歐洲除了滅活菌苗外還有類毒素疫苗，諸多研究表明，將腐敗梭菌α毒素制成類毒素免疫動(dòng)物，可抵抗不同型腐敗梭菌及孢子的攻擊[6]，利用基因工程技術(shù)制備的重組α毒素對(duì)火雞[7]和小鼠均具有免疫保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)以表達(dá)重組腐敗梭菌毒素的大腸桿菌pET28a-CSA/BL21[8]為研究對(duì)象，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，將其制成滅活疫苗，探究不同表達(dá)形式重組蛋白、裂解處理等對(duì)免疫效力的影響，為羊快疫疫苗的研制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 腐敗梭菌C55-1株(CVCC60021)、腐敗梭菌抗毒素羊血清由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；表達(dá)腐敗梭菌α毒素的E.colipET28a-CSA/BL21由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[8]；兔抗羊HRP-IgG購自Sigma公司；LB肉湯、TG培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、厭氣肉肝湯和胰酶消化湯等由北京中海公司提供；氫氧化鋁膠佐劑由中牧實(shí)業(yè)有限公司蘭州生物藥廠提供。體質(zhì)量為16 g～18 g ICR小鼠、2 kg日本大耳白家兔購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.2 重組α毒素表達(dá)條件的優(yōu)化 將E.colipET28a-CSA/BL21接種LB肉湯，37℃ 260 r/min震蕩培養(yǎng)，用對(duì)誘導(dǎo)時(shí)菌液OD600nm、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG濃度以及時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。用SDSPAGE檢測(cè)，Quantity One 4.6.2軟件分析表達(dá)量。

1.3 重組α毒素表達(dá)形式分析 以優(yōu)化后的條件誘導(dǎo)工程菌表達(dá)后，離心沉淀復(fù)溶，冰浴超聲波裂解，4℃12 000 r/min離心1 mim，分別收集上清和沉淀，SDS-PAGE分析抗原的表達(dá)形式。以腐敗梭菌抗毒素羊血清(1∶25)為一抗，兔抗羊HRP-IgG(1∶800)為二抗western blot檢測(cè)重組蛋白的反應(yīng)原性[9]。

1.4 腐敗梭菌毒素的制備 參考中國(guó)獸藥典羊快疫疫苗效力檢驗(yàn)所使用毒素的制備方法，將腐敗梭菌C55-1株接種于厭氣肉肝湯培養(yǎng)基，37℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接胰酶消化湯37℃靜置厭氧培養(yǎng)24 h，離心取上清，0.22μm濾器過濾除菌即得腐敗梭菌毒素，-80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 疫苗的制備 將誘導(dǎo)后的pET28a-CSA/BL21超聲波裂解上清(可溶性抗原)、裂解沉淀懸液(包涵體抗原)和超聲波裂解誘導(dǎo)后的全菌菌液以及未經(jīng)裂解處理誘導(dǎo)后的全菌菌液分別加入0.2%甲醛，1.4制備的腐敗梭菌毒素加0.7%甲醛用于類毒素疫苗制備[10]，密封，37℃滅活，每天輕搖4～5次，3 d后進(jìn)行滅活檢驗(yàn)(檢驗(yàn)方法：0.40 m L/只腹腔注射小鼠2只，觀察24 h，如有死亡繼續(xù)滅活)。滅活完全后加20%滅菌氫氧化鋁膠混勻后備用。

1.6 疫苗的無菌檢驗(yàn)與安全檢驗(yàn) 對(duì)所制備的各類疫苗按照現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。各類疫苗分別以5.0 m L/只皮下注射家兔各4只，觀察10 d，應(yīng)全部健活，則安全檢驗(yàn)合格。

1.7 疫苗免疫效力評(píng)價(jià)

1.7.1 不同表達(dá)形式抗原對(duì)疫苗免疫效力的影響將可溶性的重組腐敗梭菌α毒素疫苗、重組腐敗梭菌α毒素包涵體疫苗以及腐敗梭菌類毒素疫苗分別以1.0 m L/只經(jīng)頸背部皮下注射免疫家兔各5只，對(duì)照組5只不免疫。血清中和抗體效價(jià)的測(cè)定：免疫后第14 d經(jīng)耳中央動(dòng)脈采血，分離血清，將同組內(nèi)血清等量混合制成混合血清，將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的腐敗梭菌毒素與混合血清2∶1混勻，37℃孵育40 min，0.30 m L/只尾靜脈注射小鼠各2只，觀察3 d，直到血清剛好能中和毒素。攻毒保護(hù)試驗(yàn)：各組家兔免疫24 d后，全部經(jīng)耳緣靜脈注射1.4制備的1 MLD腐敗梭菌毒素，觀察各組家兔死亡情況，共觀察5 d。

1.7.2 裂解處理對(duì)全菌疫苗免疫效力的影響分別用經(jīng)超聲波裂解處理和未經(jīng)裂解處理誘導(dǎo)后的全菌滅活疫苗1.0 m L/只頸背部皮下注射免疫家兔各4只。同1.7.1測(cè)定血清中和抗體效價(jià)并攻毒。

2 結(jié)果

2.1 重組α毒素表達(dá)條件的優(yōu)化 對(duì)誘導(dǎo)時(shí)pET28a-CSA/BL21菌液OD600nm、誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度以及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，培養(yǎng)約4 h菌液OD600nm在0.850～0.950達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期時(shí)，加IPTG至0.40 mmol/L，37℃誘導(dǎo)6 h，重組α毒素表達(dá)量較高，為菌體總蛋白的25.0%(圖 1)。

2.2 重組α毒素表達(dá)形式分析 誘導(dǎo)后的重組菌液經(jīng)超聲波裂解處理，SDS-PAGE結(jié)果顯示在52 ku處有特異性目的條帶，與預(yù)期大小相符。特異性條帶的相對(duì)表達(dá)量為25%，絕對(duì)表達(dá)量為0.56mg/m L菌液。在菌液離心上清中未檢測(cè)到特異條帶，重組菌裂解上清中重組α毒素含量低于沉淀中的重組α毒素(圖1A)。結(jié)果表明，重組α毒素以包涵體和上清分泌2種形式表達(dá)，包涵體含量高于上清中的含量。Western blot結(jié)果顯示，在52 ku處有特異條帶，與預(yù)期相符(圖1B)，表明重組蛋白與腐敗梭菌抗毒素血清有較好的反應(yīng)原性。

2.3 疫苗的無菌檢驗(yàn)與安全檢驗(yàn) 制備的各類疫苗接種TG和TSB培養(yǎng)基后均無菌生長(zhǎng)；家兔5.0m L/只接種疫苗后，在觀察期內(nèi)均全部健活。表明所制備的疫苗無菌檢驗(yàn)和安全檢驗(yàn)合格，可以用于后續(xù)免疫效力評(píng)價(jià)。

2.4 疫苗的免疫效力評(píng)價(jià) 家兔免疫可溶性疫苗、包涵體疫苗、類毒素疫苗以及裂解和未經(jīng)裂解誘導(dǎo)后的全菌疫苗14 d后測(cè)定其血清中和抗體效價(jià)，21 d后用腐敗梭菌毒素攻毒。結(jié)果顯示，類毒素疫苗組家兔混合血清中和抗體效價(jià)為1 MLD/0.1m L，包涵體疫苗組為6 MLD/0.1 m L；可溶性疫苗組、裂解菌苗組和未裂解菌苗組均為8 MLD/0.1 m L；攻毒后類毒素疫苗組保護(hù)率為2/5，其余疫苗免疫組均全部保護(hù)，對(duì)照組全部死亡(表1)。結(jié)果表明，可溶性疫苗、裂解和未經(jīng)裂解全菌疫苗免疫效力相近且高于包涵體疫苗，其中可溶性疫苗免疫效率最高，且上述疫苗免疫效力均高于類毒素疫苗。

圖1 重組α毒素表達(dá)形式的SDS-PAGE分析(A)和western blot鑒定(B)Fig.1 Analysis of recombinant alpha toxin expression by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

表1 重組腐敗梭菌α毒素免疫家兔的攻毒保護(hù)試驗(yàn)Table 1 Immunoprotection of the rabbits immunized with recombinant alpha toxin of C.septicum

3 討論

現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)獸藥典》規(guī)定含有羊快疫病原組分的三聯(lián)四防滅活疫苗效力檢驗(yàn)按照血清中和法和免疫攻毒法任擇其一，而且在免疫攻毒法中既可以攻腐敗梭菌菌液也可以攻毒素。本實(shí)驗(yàn)采用血清中和法對(duì)疫苗免疫效力評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，免疫重組腐敗梭菌α毒素疫苗的家兔血清中和抗體效價(jià)均高于類毒素疫苗組和《獸藥典》規(guī)定的1 MLD/0.1m L；免疫攻毒法對(duì)疫苗免疫效力的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，各重組腐敗梭菌α毒素疫苗組全部保護(hù)，類毒素疫苗組保護(hù)率僅為40%，對(duì)照組全部死亡。其中類毒素疫苗效力評(píng)價(jià)結(jié)果與彭小兵[5]等報(bào)道相近，血清中和抗體效價(jià)為1 MLD/0.1 m L時(shí)不足以使家兔抵抗1MLD的毒素攻擊。

本實(shí)驗(yàn)中可溶性疫苗與包涵體疫苗相比前者重組α毒素含量較低，但免疫效力卻沒有因此降低，二者均誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生了很好的免疫應(yīng)答，而且可溶性疫苗免疫家兔血清中和抗體效價(jià)高于包涵體疫苗，分析認(rèn)為可溶性抗原能夠形成更完整的空間結(jié)構(gòu)，因此免疫效率更高。盡管全菌疫苗含有包涵體和可溶性兩種疫苗抗原量之和，試驗(yàn)結(jié)果也顯示全菌疫苗免疫家兔血清中和抗體效價(jià)較包涵體疫苗組更高，但卻與可溶性疫苗組效力相當(dāng)，進(jìn)一步表明可溶性疫苗免疫效率最高。誘導(dǎo)后的全菌裂解處理是否有利于有效抗原和可溶性抗原的釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答？結(jié)果顯示裂解處理與否其免疫攻毒保護(hù)和血清中和抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果相近。為獲得更為確切的結(jié)果，則需要測(cè)定最低免疫劑量，再進(jìn)行比較免疫效果的試驗(yàn)。

值得一提的是，本實(shí)驗(yàn)未經(jīng)裂解處理的全菌滅活疫苗以含重組α毒素0.45 mg的劑量免疫家兔即可實(shí)現(xiàn)較好的免疫效果，其具有抗原含量高，制備步驟少便于生產(chǎn)推廣，且有利于降低內(nèi)毒素的釋放等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，F(xiàn)erreira等報(bào)道產(chǎn)氣莢膜梭菌采用基因工程菌苗可以克服亞單位疫苗分子量小的不足，而菌體能夠發(fā)揮佐劑作用提高機(jī)體的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)了疫苗的免疫效果[11]，由此推測(cè)腐敗梭菌基因工程全菌苗也可能具有這樣的作用。安全性方面考慮，大腸桿菌基因工程菌具有很好的安全性而廣泛應(yīng)用，且采用甲醛滅活的方法既能夠使重組毒素脫毒又可以將工程菌滅活保證了轉(zhuǎn)基因生物安全，因此，基因工程全菌滅活苗不失為一種預(yù)防羊快疫的候選疫苗。綜上，含重組腐敗梭菌α毒素的基因工程疫苗具有很好的安全性和免疫保護(hù)效果。