省沽油葉枯病病原菌的分離鑒定及藥劑篩選試驗

陳嘉敏，郭茂超，朱志強，羅美林，魏 蜜

（1．湖北工程學院生命科學技術學院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室，湖北 孝感 432000；2．湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062）

【研究意義】 省沽油（Staphylea bumalda）是我國珍稀的木本油料，主要分布于浙江、江西、云南等省，現(xiàn)在北京及其以南地區(qū)也已廣泛栽培，花白如雪，給人以清新淡雅之感，在園林綠化中應用廣泛，是鄂北地區(qū)的特色經(jīng)濟作物，具有種植投入少、管理技術簡單、適種范圍廣泛、經(jīng)濟收益豐厚、勞動強度適中等優(yōu)點。因此，人工種植省沽油日漸成為農(nóng)民增收的重要渠道，并成為精準扶貧、產(chǎn)業(yè)扶貧的優(yōu)質(zhì)項目被多地基層政府在貧困山區(qū)廣泛推廣。同時，省沽油也是一種天然野生食品，其嫩葉和花朵具有很高的食用和藥用價值，被用作止咳藥、止瀉藥和產(chǎn)后血液清涼劑等[1]，且能夠降低血脂和膽固醇濃度，調(diào)節(jié)血壓，減少老年癡呆癥、癌癥及許多心血管類疾病的發(fā)生，提升人體免疫力等，在開發(fā)為保健食品上有較高的經(jīng)濟價值。此外，種子油含量和質(zhì)量都很好。有研究發(fā)現(xiàn)，種子出油率可達30%左右[2]，

其嫩葉、嫩梢和花蕾中含有豐富的不飽和脂肪酸、維生素、粗蛋白、總氨基酸和必需氨基酸等營養(yǎng)成分[3]，具有廣泛的應用前景。而2017年6月，省沽油葉枯病在湖北省孝感市農(nóng)科院試驗園被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率約為30%。受害葉片從葉尖開始發(fā)病，隨后延伸至中部甚至整個葉片，在大規(guī)模種植條件下該病害可能會普遍發(fā)生，對于省沽油工業(yè)的發(fā)展是一個潛在的巨大風險?！厩叭搜芯窟M展】 目前，國內(nèi)還未見有關于省沽油病害發(fā)生的相關報道。【本研究切入點】 為防止該病害大面積發(fā)生，造成嚴重經(jīng)濟損失，對該病害病原菌進行分離鑒定及防治藥劑篩選研究。【擬解決的關鍵問題】 通過對樣品的采集、組織分離培養(yǎng)、致病性測定、形態(tài)學觀察和分子生物學鑒定，明確了該病害的病原菌種類；并通過室內(nèi)藥劑篩選試驗，為省沽油葉枯病綜合防治措施提供一定的理論基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試省沽油葉枯病葉片和健康省沽油植株于2017年6月采自湖北省孝感市農(nóng)科院試驗園。供試藥劑：30%三環(huán)·氟環(huán)唑懸浮劑，江蘇豐登作物保護股份有限公司生產(chǎn)；30%烯?！み漉r胺懸浮劑，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司生產(chǎn)；37%戊唑·咪鮮胺水乳劑，江蘇省農(nóng)墾生物化學有限公司生產(chǎn)；80%?！じｄ\可濕性粉劑，山東慧邦生物科技有限公司生產(chǎn)。馬鈴薯購于孝感當?shù)爻校咸烟呛铜傊徲谏ど锕こ?上海)股份有限公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）[4]：馬鈴薯200 g去皮切碎，沸水加熱30 min，用紗布濾去馬鈴薯殘渣，加水補足至1000 mL，加入20 g葡萄糖和18 g瓊脂。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PD）則不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離及純化 采用組織分離法[4]對采集的病害葉片進行分離，剪取3 mm×3 mm病健交界處的葉組織，用無菌水沖洗3次后，用0.1%升汞沖洗3 min，用70%酒精再次沖洗3 min進行消毒，再用無菌水沖洗3次后，移置PDA培養(yǎng)基平板上25℃恒溫培養(yǎng)。將長出的菌落挑取邊緣菌絲進行純化，然后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 根據(jù)科赫氏法則對分離得到的純化病原菌進行致病性測定。將病原菌置于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待產(chǎn)生大量孢子后，加入無菌水沖洗，收集孢子懸浮液；選擇健康的省沽油葉片，葉片用70%酒精表面消毒后，將孢子懸浮液（1.0 × 106個孢子/mL）進行噴霧接種，以噴灑無菌水為對照。接種后14 d觀察葉片發(fā)病情況，并拍照記錄。從接種的有癥狀的葉子中再次重新分離出真菌鑒定。

1.2.3 病原菌鑒定

（1）病原菌形態(tài)學鑒定：將純化的病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后觀察菌落形態(tài)。培養(yǎng)至產(chǎn)孢后在熒光倒置顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)，選取50～100個分生孢子測量其大小取平均值。根據(jù)上述特征進行形態(tài)學鑒定。

（2）病原菌分子生物學鑒定：參照申光輝等[5]的實驗方法略作改動，獲得該病原菌的基因DNA，選用ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）和ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAA-3′）為引物進行PCR擴增，反應條件：94℃變性4 min；94℃變性30 s；55℃退火30 s、72℃延伸1 min，33個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。得到產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送往天一輝遠生物科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI網(wǎng)站通過BLAST進行同源性比較，用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

（3）病原菌脂肪酸鑒定：參照Fernandes等[6]的方法略作改動，將病原菌菌落用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（于青島海博生物技術有限公司購買）培養(yǎng)，使用脂肪酸提取劑（皂化試劑、甲基化試劑、萃取試劑和洗滌試劑，美國Fisher公司提供）對待測微生物進行脂肪酸提取，提取的脂肪酸通過全自動微生物鑒定儀進行分析鑒定，結果通過微生物細胞脂肪酸成分鑒定軟件MIS4.5（microbial identification system）和LGS4.5（library generation software）保存記錄，并與數(shù)據(jù)庫中標準菌種的脂肪酸信息進行比對。

1.2.4 室內(nèi)藥劑篩選試驗 將已滅菌的PDA培養(yǎng)基溶解，待降到適宜溫度后，按照試驗設計（表1）加入藥劑混合均勻倒入滅菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，配成對應濃度的含殺菌劑平板，取新鮮病原菌用6 mm打孔器打取菌餅接種于平板中央，以不加殺菌劑的PDA為對照，每個濃度處理3次重復，每個重復1皿，25℃恒溫培養(yǎng)7 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算試驗藥劑對病原菌生長的抑制率[7]，將抑制率轉換為幾率值[8]（y），求出供試藥劑濃度的對數(shù)值（x），用EXCEL建立毒力回歸方程式[9]，求出EC50。

表1 供試藥劑試驗濃度Table 1 The concentration of selected fungicides

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離純化及致病性測定

用分離純化的病原菌噴霧接種的省沽油葉片（圖1B，彩版見封三）從葉尖開始出現(xiàn)枯黃，隨后延伸至中部甚至整個葉片，發(fā)病癥狀與田間自然發(fā)病的省沽油葉片（圖1A）基本相同。而用無菌水噴霧的對照葉片（圖1C）表現(xiàn)為健康狀態(tài)；采取人工接種發(fā)病葉片的病健交界處進行病原菌分離培養(yǎng)，與最初分離的病原菌形態(tài)一致。根據(jù)柯赫氏法則，說明分離的病菌即為省沽油葉枯病致病菌。

圖1 省沽油葉枯病癥狀、致病性試驗結果及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

圖1 省沽油葉枯病癥狀、致病性試驗結果及病原菌形態(tài)特征Fig.1 Symptoms of Staphylea bumalda leaf blight, results of pathogenicity and colony morphology on PDA medium

2.2 病原菌形態(tài)學鑒定

觀察在PDA平板上生長的分離純化的病原菌，菌落顏色呈青灰色（圖1D），在生長7 d后長滿培養(yǎng)皿( 直徑9 cm) 。在顯微鏡下觀察，分生孢子呈倒棒狀，串聯(lián)成長鏈狀，大小為3.5～15.8 μm×7.6～46.5 μm，有 2～10個橫隔膜和 0～3個縱斜隔膜（圖1E、F）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征初步鑒定該病害是由互隔交鏈孢霉（A.alternate）真菌引起的。

2.3 病原菌分子生物學鑒定

病原菌的rDNA-ITS 區(qū)域經(jīng)PCR擴增產(chǎn)物，獲得了590 bp 左右的堿基序列，將該序列提交至GenBank（登錄號:MF614038） 。利用 BLAST 搜索，用MEGA 6.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與A.Alternate MG569550菌株的ITS序列相似度達99%（圖2）。結合病原菌的形態(tài)特征及ITS序列分析，確定該病害病原菌為互隔交鏈孢霉（A.alternate）。

圖2 病原菌ITS聚類分析結果Fig.2 Dendrogram of cluster analysis on pathogen constructed based on rDNA-ITS sequences

2.4 病原菌脂肪酸鑒定

根據(jù)全自動微生物鑒定儀匹配結果，依據(jù)Buyer等[10]的原則：相似度（similarity index，SI）是指待測菌株與系統(tǒng)譜庫中的標準菌株數(shù)值的匹配程度。相似度＜0.2，結果不可用。通過表2脂肪酸鑒定結果與2.3鑒定結果相互驗證，發(fā)現(xiàn)與A.alternate最相似，相似度為0.517。

表2 供試病原菌菌株脂肪酸鑒定結果Table 2 Results of fatty acid identification of tested pathogen strains

2.5 室內(nèi)藥劑篩選

由表3可知，供試的4種殺菌劑對省沽油葉枯病的生長都有抑制作用。其中殺菌劑37%戊唑·咪鮮胺水乳劑EC50最低，為0.400 4 μg/mL，其抑菌效果最好，在藥劑包裝推薦使用濃度基礎上稀釋50倍，其相對抑菌率達78.5%，在推薦使用濃度基礎上再稀釋5 000倍，仍有抑菌作用，抑菌率達42.8%。其次是30%烯?！み漉r胺懸浮劑和80%福·福鋅可濕性粉劑，EC50分別為1.461 9、1.756 2 μg/mL，抑菌效果較好，30%烯酰·咪鮮胺在藥劑包裝推薦使用濃度基礎上稀釋10倍，其相對抑菌率達83.7%；80%?！じｄ\在藥劑包裝推薦使用濃度基礎上稀釋20倍，其相對抑菌率達82.2%，兩者同時在推薦使用濃度基礎上再稀釋4 000倍，也仍有抑菌作用，抑菌率達39%。最后是30%三環(huán)·氟環(huán)唑懸浮劑，EC50為6.055 9 μg/mL，該藥劑在推薦使用濃度基礎上稀釋20倍，抑菌率達75.8%，在推薦使用濃度基礎上再稀釋1 000倍，抑菌率達38.4%，相較于37%戊唑·咪鮮胺、30%烯?！み漉r胺和80%福·福鋅抑菌效果較差。

表3 不同殺菌劑對病原菌的毒力Table 3 Toxicity of different fungicides on the pathogen

3 討論

鏈格孢屬（Alternaria alternate）是一種全球常見的半知菌暗色絲孢菌，遍布自然界和人類居住的室內(nèi)環(huán)境中，95%以上的種類兼性寄生于植物上?？梢鸲瑮椇诟11]、鴨梨黑斑病[12]、葡萄穗軸褐枯病[13]等水果病害；同時，鏈格孢屬真菌還廣泛寄生于農(nóng)作物，引起甜瓜[14]、馬鈴薯[15]、大豆[16]、西葫蘆和南瓜[17]等數(shù)十種作物的病害，以及柚木[18]、冬青衛(wèi)矛[19]和單葉蔓荊[20]等園林植物病害，給國內(nèi)外農(nóng)業(yè)和水果產(chǎn)業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。美國曾報道由瓜鏈格孢（A.cucumerina）和茄鏈格孢（A.dauci（Kuhn）Groves et Skolko f.sp.solani）引起的葉斑病和大豆猝倒病極度限制了美國甜瓜和西葫蘆等的種植，使伊利洛斯州的大豆產(chǎn)量損失15%。在我國，蔥鏈格孢（A.porri）引起的大蔥紫斑病限制我國蔥的出口，造成經(jīng)濟損失達5 000萬元[21]。因此，為避免省沽油在產(chǎn)業(yè)化種植中出現(xiàn)該病害浸染，對該病害的鑒定及初步防治研究十分必要。

4 結論

本研究通過田間調(diào)查和采集樣品，使用柯赫氏法則進行致病性測定，并利用形態(tài)學觀察、分子生物學和脂肪酸鑒定，明確了省沽油葉枯病的病原菌為互隔交鏈孢霉（A.alternate）。經(jīng)過查閱國內(nèi)文獻發(fā)現(xiàn)，由A.alternate引起的省沽油葉枯病為國內(nèi)首次報道。同時為了避免該病害發(fā)生時盲目使用殺菌劑，對該病害進行室內(nèi)防治藥劑篩選，結果發(fā)現(xiàn)在供試藥劑中，戊唑·咪鮮胺抑菌效果最好，EC50為0.4004 g/mL，其次是烯?！み漉r胺、?！じｄ\和三環(huán)·氟環(huán)唑。但室內(nèi)藥劑篩選結果由于采用平板打孔法測定，結果會受到藥劑擴散能力與藥劑產(chǎn)品批號等的影響，具一定局限性。因此，本試驗測定結果只可為省沽油葉枯病的田間藥劑防治試驗提供借鑒基礎。