雷洛昔芬通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡保護(hù)腦缺血大鼠腦細(xì)胞的機(jī)制研究

管 萍， 劉文娟， 盧鵬超， 李志紅

腦血管病是一種常見的多發(fā)性疾病，死亡率和致殘率較高，近年來我國死亡原因中排名第二[1]。急性缺血性腦血管病占腦血管疾病的43%～65%，死亡率為15%～25%，嚴(yán)重危害人類健康[2]。雷洛昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑[3]。它是苯基唾液酚的合成非甾體衍生物，具有一定的組織特異性[4]。在生殖系統(tǒng)組織中，雷洛昔芬作為雌激素受體拮抗劑，可抑制乳腺和子宮腫瘤的生長，在生殖系統(tǒng)外的組織中起部分雌激素受體激動劑的作用，可以防止骨質(zhì)鈣流失和降低血清膽固醇水平[5]。

1 材料和方法

1.1 一般資料 選取體重在(240±20)g的雄性Wistar大鼠為研究。分為空白對照組、假手術(shù)組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組，每組10只大鼠。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠大腦中動脈栓塞模型 腹腔注射3.5%水合氯醛(0.35 g/kg)，麻醉后分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈結(jié)扎。在頸總動脈近頸內(nèi)外支切口處，通過切口將16 mm～17 mm長的尼龍繩插入頸總動脈內(nèi)結(jié)扎。完全插入大腦中動脈。注射尼龍線后，動物的右眼瞼下垂。動物在醒來后向左移動了一個圈，說明模型是成功的。假手術(shù)組頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈分離結(jié)扎[6]。

1.2.2 分組及給藥 將手術(shù)組隨機(jī)分成3組即雷洛昔芬低劑量組(10 mg/kg bw)、雷洛昔芬中劑量組(50 mg/kg bw)、雷洛昔芬高劑量組(100 mg/kg bw)，每天灌胃不同劑量的雷洛昔芬溶液，正常對照組及假手術(shù)組每天灌胃等劑量的生理鹽水，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)30 d。

1.2.3 海馬組織分離及培養(yǎng) 處死大鼠前，用酒精棉球擦拭全身，初步消毒。再次浸泡在75%的酒精中，1 min后取出，打破頭部。將頭皮和頭骨切掉。打開大腦皮層，用眼鉗取雙側(cè)海馬，置于種植培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中。顯微鏡下，用顯微眼科鉗切除腦膜，切除海馬以外的腦組織。用DISGH溶液沖洗3次，用微眼剪(約1 mm)切斷海馬，加入0.125%胰蛋白酶溶液，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化約20 min，加入與組織懸液等量的20%小牛血清培養(yǎng)基10 min，終止胰蛋白酶作用，添加10%胎牛血清和10%小牛血清的培養(yǎng)基，形成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞計數(shù)后，用DMEM溶液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×106，將細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，5% CO2,95%空氣，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后通過MTT實驗測定其生長情況。

1.2.4 神經(jīng)元加鈣 取神經(jīng)上皮組織，制成細(xì)胞懸液，用無鎂BSS漂洗3次，加入含3 μmol Fluo-3/AM的無鎂BSS 1 ml在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min。然后用Fluo-3/AM游離無鎂BSS代替原液，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，確保AM組在Fluo-3/AM細(xì)胞質(zhì)冷卻酶的作用下完全去除。

1.2.5 神經(jīng)元內(nèi)鈣含量測定 細(xì)胞內(nèi)鈣濃度與Fluo-3熒光強(qiáng)度成正比，因此細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)可實時檢測細(xì)胞內(nèi)Fluo-3熒光強(qiáng)度的變化。熒光-3熒光激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為530 nm，激光激發(fā)強(qiáng)度調(diào)節(jié)到最小。在此條件下，F(xiàn)luo-3本身的熒光猝滅在檢測時間(900 s)內(nèi)可以忽略不計。

1.2.6 神經(jīng)元活性的測定 通過MTT實驗對神經(jīng)元細(xì)胞的活性進(jìn)行測定。取部分上述分離得到的細(xì)胞，利用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度至1×107個/ml，加到96孔板中，每孔100 μl，以等體積的完全培養(yǎng)基為調(diào)零孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，向各孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，培養(yǎng)4 h，棄上清，向各孔中加入150 μl DMSO，水平振動儀中快速震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上測定570 nm處吸光度值。

1.2.7 神經(jīng)元細(xì)胞凋亡測定 吸取5 μl Annexin V-FITC凋亡試劑于細(xì)胞中，混勻，室溫下避光孵育15 min，加入1×binding buffer，重懸細(xì)胞，1200 rpm，離心5 min，棄上清，加200 μl×binding buffer，重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。流式軟件Flowjo 7.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.8 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的測定 采用Western blot 方法對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白即caspase-3蛋白、Bcl-2蛋白及Apaf-1蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行測定，通過Image J軟件對條帶的灰度值進(jìn)行測定，利用灰度值分析各蛋白的表達(dá)量。

1.2.9 細(xì)胞凋亡RNA表達(dá)量的測定 取大鼠血清，利用RT-PCR方法檢測血液中miRNA-21、miRNA-29因子的表達(dá)水平。利用總miRNA快速提取試劑盒提取總RNA，并使用miRNA特有的逆轉(zhuǎn)錄引物，將其與Super M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反向轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系：(1)5×PrimeScript Buffer 4 μl；(2)1×PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μl；(3)Oligo dT Primer (50 μmol)1 μl (25 pmol)；(4)Random 6 mers (100 μmol) 1 μl (50 pmol)；(5)Total RNA 1 μl；RNase Free dH2O 12 μl 。RT-PCR在實時定量系統(tǒng)中上進(jìn)行，擴(kuò)增條件：(1)預(yù)變性：95 ℃時10 min；(2)變性：94 ℃時30 s、退火/延伸：60 ℃時1 min，兩個步驟40個循環(huán)；(3)融解曲線分析：95 ℃時15 s、60 ℃時1 min、94 ℃時15 s和60 ℃時15 s。引物設(shè)計(見表1)；反應(yīng)體系(見表2)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元形態(tài)完整性分析 神經(jīng)元形態(tài)完整，胞體和突起清晰，胞體呈椎體或多角形，突起明顯。用大鼠特異性烯醇化酶(NSE)抗體鑒定培養(yǎng)細(xì)胞，表明神經(jīng)元(NSE陽性細(xì)胞)純度達(dá)95%(見圖1)。

2.2 神經(jīng)元鈣含量的測定 以3×104mol/L谷氨酸培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞1 min后，細(xì)胞內(nèi)鈣濃度迅速升高。大約95%的細(xì)胞有反應(yīng)。用無鎂BSS洗滌2.5 min后，雷洛昔芬組，再次給予谷氨酸，治療前后谷氨酸誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度升高。結(jié)果表明，不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。空白組、假手術(shù)組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度分別為(230.2±10.3)、(233.5±11.3)、(342.3±12.4)、(302.5±14.5)、(312.3±13.5)，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=160.033，P<0.001)。與空白對照組的熒光強(qiáng)度相比，假手術(shù)組無顯著變化(P>0.05)，雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強(qiáng)度均顯著增加(P<0.001)，但與雷洛昔芬低劑量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強(qiáng)度均顯著降低(P<0.001)。

2.3 神經(jīng)元細(xì)胞活性及凋亡率測定 通過MTT實驗對神經(jīng)元細(xì)胞增殖能力進(jìn)行測定，利用流式細(xì)胞儀對其凋亡率進(jìn)行測定，實驗結(jié)果表明，空白組、假手術(shù)組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細(xì)胞的增殖率分別為(0.68±0.02)、(0.66±0.02)、(0.21±0.01)、(0.59±0.03)、(0.54±0.04)，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=534.265，P<0.001)。假手術(shù)組細(xì)胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞增殖率均顯著低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。細(xì)胞凋亡率結(jié)果表明，空白組、假手術(shù)組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細(xì)胞的凋亡率分別為(1.1±0.03)、(1.2±0.02)、(10.38±0.23)、(8.92±0.12)、(9.01±0.21)，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9288.651，P<0.001)。假手術(shù)組細(xì)胞增殖率與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞增殖率均顯著低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白分析 用2-△△Ct法計算細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Apaf-1的相對表達(dá)量，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F1=38.328，F(xiàn)2=1151.204，P<0.001)，結(jié)果(見圖2、表3)。 細(xì)胞凋亡率凋亡相關(guān)蛋白表明，假手術(shù)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達(dá)量有顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)(見圖2)。

2.5 miRNA表達(dá)量的測定 通過RT-PCR實驗對神經(jīng)元細(xì)胞凋亡相關(guān)miRNA表達(dá)量進(jìn)行測定，實驗結(jié)果表明，空白組、假手術(shù)組、雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組各組細(xì)胞的miRNA-21表達(dá)量分別為(0.14±0.01)、(0.16±0.01)、(0.32±0.02)、(0.21±0.01)、(0.22±0.01)，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=306.250，P<0.001)。假手術(shù)組細(xì)胞miRNA-21表達(dá)量與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞miRNA-21顯著高于空白組與假手術(shù)組(P<0.05)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞miRNA-21表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。各組miRNA-29表達(dá)量分別為(0.17±0.02)、(0.19±0.01)、(0.43±0.03)、(0.31±0.02)、(0.32±0.02)，5組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=256.364，P<0.001)。假手術(shù)組細(xì)胞miRNA-29表達(dá)量與空白組相比無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞miRNA-29顯著高于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞miRNA-29表達(dá)量均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞miRNA-29表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

表1 引物設(shè)計

表2 反應(yīng)體系

表3 神經(jīng)元細(xì)胞增殖能力、凋亡蛋白及相關(guān)miRNA表達(dá)量測定

A：空白組;B：假手術(shù)組;C:雷洛昔芬低劑量組;D:雷洛昔芬中劑量組;E:雷洛昔芬高劑量組,雷洛昔芬中、高劑量組熒光強(qiáng)度降低(P>0.05)

圖1 神經(jīng)元形態(tài)和神經(jīng)元鈣含量的測定

假手術(shù)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞caspase-3、Apaf-1蛋白低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中、高劑量組細(xì)胞中caspase-3、Apaf-1蛋白增加(P<0.001)

圖2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)量的Western blot測定結(jié)果

3 討 論

雷洛昔芬在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也引起了越來越多的關(guān)注[5]?，F(xiàn)有的一些體內(nèi)實驗結(jié)果表明，雷洛昔芬對氧化應(yīng)激和β-淀粉樣蛋白所致的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用[7]。也有證據(jù)表明雷洛昔芬對中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺受體具有雌激素激動劑活性，提示雷洛昔芬可能作為雌激素激動劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[8]。此外，雷洛昔芬神經(jīng)保護(hù)作用的細(xì)胞和分子機(jī)制尚不清楚。

有研究表明[9]，雷洛昔芬能抑制過氧化應(yīng)激所致的神經(jīng)元死亡，這種作用不是由經(jīng)典雌激素受體介導(dǎo)的。報道指出[10]，雷洛昔芬對雌激素受體α誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有抑制作用，再生的作用還取決于經(jīng)典雌激素受體介導(dǎo)的。有報道指出[11]，谷氨酸可直接激活細(xì)胞膜上配體激活的鈣通道，引起細(xì)胞膜膨脹Ca2+內(nèi)流，同時引起細(xì)胞膜去極化，激活電壓依賴性鈣通道，進(jìn)一步引起鈣內(nèi)流和鈣超載[12]。本研究以3×104mol/L谷氨酸培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，結(jié)果表明，不同濃度的雷洛昔芬可顯著降低谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣的增加。與空白對照組的熒光強(qiáng)度相比，假手術(shù)組無顯著變化(P>0.05),雷洛昔芬低劑量組、雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強(qiáng)度均顯著增加(P<0.001)，但與雷洛昔芬低劑量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組熒光強(qiáng)度均顯著降低(P<0.001)。

在體內(nèi)動物實驗的結(jié)果表明[13]，雷洛昔芬在腦缺氧缺血損傷的實驗?zāi)Ｐ椭袑ι窠?jīng)元具有明顯的保護(hù)作用，同時體外細(xì)胞研究也證實[14,15]，雷洛昔芬在氧化應(yīng)激、興奮毒性及β-淀粉樣蛋白引起的神經(jīng)元損傷中增加了神經(jīng)元的存活且對其具有保護(hù)作用。本研究表明，通過MTT實驗對神經(jīng)元細(xì)胞增殖能力進(jìn)行測定，利用流式細(xì)胞儀對其凋亡率進(jìn)行測定，實驗結(jié)果表明，雷洛昔芬組細(xì)胞增殖率與凋亡率均顯著低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞增殖率無顯著性差異(P>0.05)。

細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白即caspase-3、Apaf-1的表達(dá)結(jié)果表明，假手術(shù)組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Apaf-1與空白組相比蛋白表達(dá)量無顯著性(P>0.05)，雷洛昔芬組細(xì)胞caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著低于空白組與假手術(shù)組(P<0.001)，但與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞中caspase-3、Apaf-1蛋白均顯著增加(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組caspase-3、Apaf-1蛋白表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。與雷洛昔芬低價量組相比，雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞miRNA-21、miRNA-29表達(dá)量均顯著降低(P<0.001)，且雷洛昔芬中劑量組、雷洛昔芬高劑量組細(xì)胞miRNA-21、miRNA-29表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述：雷洛昔芬通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、Apaf-1及miRNA-21、miRNA-29的表達(dá)保護(hù)腦缺血大鼠腦細(xì)胞。