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    燈盞細(xì)辛中多酚化合物的提取及體外抗氧化活性研究

    2019-05-09 09:12:38朱靜靜羅霞趙存朝黃艾祥
    食品研究與開發(fā) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:燈盞光度自由基

    朱靜靜,羅霞,趙存朝,黃艾祥

    (云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650201)

    燈盞細(xì)辛(Erigeron breviscapus),別名燈盞花,屬菊科植物短葶飛蓬的干燥全草,原系云南民間苗族、彝族、德昂族等少數(shù)民族習(xí)用草藥[1],云南省能入藥的燈盞花資源占全國資源總量的95%以上,成為云南省內(nèi)天然藥材的主要資源,在云南省分布很廣,文山、大理、麗江、迪慶、紅河等地州都有生長[2],燈盞細(xì)辛在藥物方面的研究應(yīng)用較廣,但在食品中的應(yīng)用卻鮮見報(bào)道。

    本試驗(yàn)采用超聲波輔助有機(jī)溶劑提取燈盞細(xì)辛多酚,在單因素試驗(yàn)之后,進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),篩選最佳提取工藝,并進(jìn)行體外抗氧化活性分析,為燈盞細(xì)辛在食品的開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    燈盞細(xì)辛:云南省大理州劍川縣金華鎮(zhèn)河?xùn)|村燈盞細(xì)辛種植戶;沒食子酸:北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院;DPPH、H2O2、ABTS:上海晶純生化科技股份有限公司;福林酚試劑:sigma 公司。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    超聲波清洗機(jī)(Scientz-500):寧波新芝生物科技有限公司;離心機(jī)(TDL-5-A):上海安亭科學(xué)儀器廠;數(shù)字型pH 計(jì)(pHS-3E):上海精密科學(xué)儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4):金壇市城西麗華實(shí)驗(yàn)儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA):上海亞榮生化儀器公司;分光光度計(jì)(URA14M0018):上海翱藝儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 燈盞細(xì)辛多酚提取方法

    準(zhǔn)確稱取1 g 燈盞細(xì)辛粉末,加入提取溶劑,超聲輔助提取之后離心,取上清液于35 ℃下濃縮后定容至50 mL,測定多酚含量。

    1.3.2 多酚含量的測定

    利用沒食子酸溶液濃度和吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立回歸方程為 Y=0.009 3x+0.102 7(10 μg/mL~60 μg/mL,R2=0.999),式中:Y 為吸光度,x 為沒食子酸濃度(μg/mL),多酚含量以每克燈盞細(xì)辛樣品中沒食子酸當(dāng)量(μg)表示。

    多酚含量采用Folin-Ciocalteau 法進(jìn)行測定,參照參考文獻(xiàn)[3]中方法,略作修改,具體步驟如下:吸取多酚粗提液0.5 mL,加入Folin-Ciocalteau 試劑,充分振搖,加入飽和碳酸鈉溶液和蒸餾水,充分混勻。25 ℃下避光反應(yīng)離心,用乙醇代替多酚粗提液作為調(diào)零,在725 nm 波長處測定吸光度。

    1.3.3 單因素試驗(yàn)

    分別研究不同提取溶劑(70%丙酮、70%乙醇、1%鹽酸-乙醇混合溶液(1.86∶98.14,體積比)、不同料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)]、不同超聲時(shí)間(5、20、35、50、65 min)和不同提取溫度(30、40、50、60、70 ℃)下燈盞細(xì)辛多酚的提取效果,確定最佳提取工藝。

    1.3.4 優(yōu)化試驗(yàn)

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以燈盞細(xì)辛多酚含量為響應(yīng)值,對料液比(g/mL)、超聲時(shí)間(min)、提取溫度(℃)進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)。優(yōu)化燈盞細(xì)辛多酚提取工藝條件。響應(yīng)面分析因素及水平見表1。

    表1 響應(yīng)面分析因素及水平Table 1 Factors and levels used in response surface analysis

    1.3.5 體外抗氧化活性測定

    1.3.5.1 DPPH 自由基清除率測定[4]

    用沒食子酸濃度和DPPH 自由基清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.003 4x+0.318 6 (32 μg/mL~192 μg/mL,R2=0.992 5),式中:Y 為 DPPH 自由基清除能力,x 為沒食子酸濃度(μg/mL)。

    吸取多酚粗提液,加入31 μg/mL DPPH 溶液,充分振搖后,室溫25 ℃下暗處放置,在517 nm 處測定吸光度,甲醇替代多酚溶液作為空白,甲醇代替DPPH 溶液進(jìn)行調(diào)零。

    式中:A0為空白吸光度,An為樣品吸光度。

    1.3.5.2 H2O2清除活性測定

    利用沒食子酸測定H2O2清除活性[5],得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=0.030 7x-0.003 4(1.28 μg/mL~7.68 μg/mL,R2=0.996 2),式中:Y 為 H2O2清除能力,x 為沒食子酸濃度(μg/mL)。

    吸取多酚粗提液,加入40 mmol/L 的H2O2溶液,加入pH 值為7.4、45 mmol/L 磷酸鈉緩沖溶液,反應(yīng)后,于230 nm 測定吸光度,甲醇替代沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白,磷酸鹽緩沖液代替H2O2溶液進(jìn)行調(diào)零。

    式中:A0為空白吸光度,An為樣品吸光度。

    1.3.5.3 羥自由基清除能力測定[6]

    利用沒食子酸濃度和·OH 清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲:Y=0.006 1x+0.046 9 (16 μg/mL~96 μg/mL,R2=0.991 4),式中:Y 為·OH 自由基清除能力,x 為沒食子酸濃度(μg/mL)。

    反應(yīng)體系中加入9 mmol/L FeSO4和9 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液,然后加入多酚粗提液,最后加入8.8 mmol/L H2O2啟動反應(yīng)??瞻讓φ找褐屑尤爰状继鎿Q同體積的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。37 ℃條件下保溫30 min,以甲醇為參比液,在510 nm 測定吸光值。

    式中:A0為空白吸光度,An為樣品吸光度。

    1.3.5.4 總抗氧化能力測定

    利用沒食子酸濃度和ABTS+自由基清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,Y=0.010 9x+0.057 6(9.6 μg/mL~57.6 μg/mL,R2=0.992 6),式中:Y 為 ABTS+自由基清除能力,x 為沒食子酸濃度(μg/mL)。

    吸取多酚粗提液,加入ABTS+自由基稀釋工作液,室溫25 ℃下反應(yīng),于734 nm 測定吸光度,甲醇替代沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白,甲醇代替ABTS+自由基稀釋工作液進(jìn)行調(diào)零。

    式中:A0為空白吸光度,An為樣品吸光度。

    1.3.5.5 還原能力測定

    建立回歸方程為Y=2.375x+0.016 7(0.08 μg/mL~0.48 μg/mL,R2=0.995 3),于 700 nm 下測定。式中:Y 為還原能力,x 為沒食子酸濃度(μg/mL)。

    以上自由基清除能力和還原能力表示為每克干燥樣品中沒食子酸當(dāng)量(μg/g)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 提取溶劑

    不同提取溶劑對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響結(jié)果如圖1所示。

    圖1 提取溶劑對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction of Erigeron breviscapus

    由圖1可見,燈盞細(xì)辛在丙酮、乙醇、鹽酸-乙醇3 種試劑提取條件下,鹽酸-乙醇溶液提取的多酚量明顯高于用丙酮和乙醇溶液提取的。很多關(guān)于多酚提取的研究中最佳提取溶劑為70%的乙醇[7-8],也有研究表明丙酮對花椒多酚的提取效果最佳[9]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示選取1%鹽酸-乙醇作為提取溶劑提取效果最佳,符合pH 值低時(shí),以分子狀態(tài)存在的多酚較多[10]這一說法。

    2.1.2 料液比

    不同料液比對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響結(jié)果如圖2所示。

    圖2 不同料液比對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響Fig.2 The effects of different materials liquid on extraction of Erigeron breviscapus

    如圖2所示,隨著料液比增大,多酚提取率逐漸上升,當(dāng)達(dá)到1∶30(g/mL)后提取率開始緩慢下降,后又出現(xiàn)上升現(xiàn)象,從節(jié)約溶劑的角度考慮,料液比選擇1∶30(g/mL)。

    2.1.3 超聲時(shí)間

    不同超聲時(shí)間對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響結(jié)果如圖3所示。

    圖3 不同超聲時(shí)間燈盞細(xì)辛多酚得率的影響Fig.3 The effects of different ultrasound time on extraction of Erigeron breviscapus

    由圖3看出,燈盞細(xì)辛多酚的最佳超聲時(shí)間是35 min,從理論上看,超聲時(shí)間越長對酚類的提取就越充分,但是長時(shí)間超聲振動導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)破壞,超聲時(shí)間的延長增加了試驗(yàn)周期及能耗[11],綜合考慮,選擇35 min 為最佳超聲時(shí)間。

    2.1.4 提取溫度

    不同提取溫度對燈盞細(xì)辛多酚提取的影響結(jié)果如圖4所示。

    圖4 不同提取溫度燈盞細(xì)辛多酚得率的影響Fig.4 The effects of different temperature on extraction of Erigeron breviscapus

    由圖4可以看出燈盞細(xì)辛多酚的提取率隨著溫度的升高先增大后減小,當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)提取率最大??赡苁歉邷卦斐煞宇愇镔|(zhì)的氧化而損失,從而造成總酚的提取率減少[12],此外在高溫條件下也會導(dǎo)致乙醇揮發(fā),使液料比改變,從而影響多酚的提取率[13]。

    綜上可知,燈盞細(xì)辛多酚的單因素提取條件是:1 %鹽酸-乙醇作為提取溶劑、料液比 1∶30(g/mL)、超聲時(shí)間35 min、提取溫度60 ℃。

    2.2 多酚提取的響應(yīng)面優(yōu)化工藝

    在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,用1%鹽酸-乙醇為提取溶劑,以A 料液比、B 提取溫度、C 超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素,進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化燈盞細(xì)辛中多酚化合物的提取工藝[14],試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

    表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果Table 2 Response surface analysis program and results

    2.2.1 模型建立及顯著性檢驗(yàn)

    利用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2進(jìn)行多元回歸擬合,得到燈盞細(xì)辛中多酚含量對料液比(A)、提取溫度(B)、超聲時(shí)間(C)的回歸模型方差分析表。模型的方差分析結(jié)果如表3所示。

    表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of the developed quadratic regression model

    得到多酚含量對料液比(A)、超聲時(shí)間(B)、提取溫度(C)的回歸模型方程為:

    從方差分析可以看出,回歸模型F=75.59,P<0.000 1,說明二次多元回歸模型極顯著;失擬項(xiàng)F=5.926,P=0.0592,模型失擬不顯著;說明模型擬合程度比較好。根據(jù)F 值可知,各個(gè)因素對燈盞細(xì)辛多酚提取率影響的大小順序?yàn)椋撼晻r(shí)間(C)>料液比(A)>提取溫度(B)。

    2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

    2.2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化顯著性分析

    通過觀察圖5中響應(yīng)面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映料液比(A)、提取溫度(B)、超聲時(shí)間(C)之間交互作用對燈盞細(xì)辛多酚提取量的影響。結(jié)果見圖5。

    圖5 各因素交互作用對多酚提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response of each factor to the effect of polyphenol extraction on the response surface and contour map

    由圖5a 可知,提取溫度和料液比對燈盞細(xì)辛多酚提取量影響均較顯著,與方差分析結(jié)果相符。由圖5b可知,超聲時(shí)間對多酚提取量的影響更顯著一些。由圖5c 可知,提取溫度比超聲時(shí)間的變化曲面平緩一些,說明超聲時(shí)間較提取溫度對多酚提取量的影響顯著,與方差分析結(jié)果相符。當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬蹄形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著[15-16]。

    2.2.2.2 最佳條件的確定和回歸模型的驗(yàn)證

    響應(yīng)面驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果如表4。

    表4 響應(yīng)面驗(yàn)證性試驗(yàn)表Table 4 Test table of response surface verification

    由表4可知,通過響應(yīng)面法得到超聲波輔助提取燈盞細(xì)辛多酚最佳工藝條件為A 料液比1∶30(g/mL)、B 提取溫度53.25 ℃、C 超聲時(shí)間50 min,在此條件下預(yù)測得到的多酚含量為11.34 mg/g。實(shí)際操作中稍作調(diào)整確定的最佳工藝條件為料液比1∶30(g/mL)、提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間50 min,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得到的多酚含量為11.01 mg/g,與理論值很接近,可信度較高。

    2.3 燈盞細(xì)辛多酚體外抗氧化活性

    2.3.1 DPPH 自由基、H2O2和 ABTS+自由基的清除能力

    燈盞細(xì)辛多酚對DPPH 自由基、H2O2和ABTS+自由基的清除能力結(jié)果見圖6。

    圖6 抗氧化活性比較Fig.6 Comparison of antioxidant activity

    由圖6可以看出,燈盞細(xì)辛多酚對H2O2、DPPH自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力,且對3 種自由基的清除能力存在一定的差異。通過體外抗氧化能力評價(jià):DPPH 自由基清除能力可達(dá)86.45%,H2O2清除活性可達(dá)91.52 %,ABTS+自由基清除能力可達(dá)91.05%。燈盞細(xì)辛多酚的抗氧化活性隨著多酚濃度的升高而不斷增大,說明多酚濃度與抗氧化能力成正相關(guān)。

    2.3.2 自由基清除能力的穩(wěn)定性比較

    燈盞細(xì)辛多酚清除能力的穩(wěn)定性比較見圖7。

    由圖7看出,DPPH 自由基清除能力隨著時(shí)間的延長而不斷升高,而H2O2清除活性與還原能力則隨著時(shí)間的延長,期初呈現(xiàn)下降的趨勢,逐漸平緩,說明燈盞細(xì)辛多酚的DPPH 自由基、H2O2清除活性以及還原能力很不穩(wěn)定;而燈盞細(xì)辛多酚的ABTS+自由基清除能力受時(shí)間影響較小,說明燈盞細(xì)辛多酚的總抗氧化穩(wěn)定性較好。

    圖7 抗氧化穩(wěn)定性比較Fig.7 Comparison of antioxidant stability

    3 結(jié)論

    利用響應(yīng)面法對燈盞細(xì)辛多酚的提取條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳提取工藝條件為:1%鹽酸-乙醇混合溶液(1.86∶98.14,體積比)、料液比 1∶30(g/mL)、提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間50 min,在此條件下得到的多酚含量為11.34 mg/g。抗氧化活性試驗(yàn)表明燈盞細(xì)辛多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力,說明燈盞細(xì)辛在食品工業(yè)中有一定的研發(fā)價(jià)值。

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