丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較研究

鄭麗雪，黎英，王家皓，董苗苗，陳倩倩，齊斌，*

（1.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500；2.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500）

長(zhǎng)久以來，抑菌防腐一直是食品工業(yè)的研究重點(diǎn)，而山梨酸鉀、苯甲酸鈉等化學(xué)合成防腐劑因抑菌效果好且價(jià)格低廉而被廣泛應(yīng)用[1-4]。伴隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、時(shí)代進(jìn)步，人們對(duì)生活質(zhì)量的要求也逐步提高，更加關(guān)注衣食住行的品質(zhì)，這對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和健康提出了新的要求。傳統(tǒng)食品防腐劑如苯甲酸鈉等，多來源于化學(xué)合成，盡管價(jià)格低廉，但大劑量應(yīng)用仍存在安全風(fēng)險(xiǎn)[5]。因此，高效、低毒防腐劑的開發(fā)依舊是食品科學(xué)研究的熱點(diǎn)問題，而天然防腐劑具備這一特性，也能滿足人們對(duì)高品質(zhì)食品的需求。

微生物、植物產(chǎn)生的天然防腐劑廣泛應(yīng)用于食品、化妝品行業(yè)[6-12]。丙酸桿菌代謝物近年作為新型食品防腐劑也越來越得到國(guó)內(nèi)學(xué)者的重視和青睞。丙酸桿菌代謝物是由乳品丙酸桿菌合成的細(xì)菌素，細(xì)菌素主要是多肽或蛋白質(zhì)，其可通過多種機(jī)制抑制腐敗菌[13-15]，已有研究表明，丙酸桿菌的代謝物質(zhì)對(duì)食品的防腐也有一定的作用。賈彩鳳[15]發(fā)現(xiàn)丙酸桿菌代謝物對(duì)惡臭假單胞菌具有抑制作用，并發(fā)現(xiàn)：5%的接種量，30 ℃培養(yǎng)72 h，丙酸桿菌代謝物抑菌活性較高。陳玉梅[16]比較了乳酸鈉（sodium lactate broth，SLB）SLB、葡萄糖和脫脂乳3 種培養(yǎng)基對(duì)其丙酸桿菌代謝物抑菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)：1%接種量的丙酸桿菌在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第8天時(shí)的抑菌活性最高。王海晶[17]研究了丙酸桿菌代謝物的抑菌作用，并對(duì)高產(chǎn)菌株發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)：丙酸桿菌代謝物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為19.8 mm；葡萄糖、Tween 80、pH 值是影響抑菌活性的關(guān)鍵發(fā)酵參數(shù)。鑒與此，本文以費(fèi)氏丙酸桿菌素為研究對(duì)象，以大腸桿菌和沙門氏菌為其指示菌，通過改變發(fā)酵培養(yǎng)基、接種量和初始培養(yǎng)pH 值3 方面，研究其代謝產(chǎn)物丙酸桿菌素對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，并與山梨酸鉀的抑菌作用進(jìn)行對(duì)比，旨在為以后天然防腐劑的深入研究提供理論參考[18]。

1 材料與方法

1.1 材料

費(fèi)氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii CS1420，P.freudenreichii CS1420）、大腸桿菌、沙門氏菌：均為常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院發(fā)酵工程中心保存。

山梨酸鉀（純度＞99.0%）、氯化鈉（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；乳酸鈉（純度98%）、葡萄糖（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鉀（純度99.8%）：阿拉丁上海阿拉丁生化科技股份有限公司；胰酶水解酪素、酵母提取物、LB 液體培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100A 型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHP-9162303A-5S 型電熱恒溫培養(yǎng)箱；FA604A 型精密電子天平：上海精天電子儀器有限公司；UV-2450 型紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；PE20 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)：梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司；Milli-Q Advantage 超純水儀：美國(guó)Millipore 公司；SW-CJ-1B 超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；CR22GⅡ型高速冷凍離心機(jī)：日本日立公司；Bio-Rad x Mark 酶標(biāo)儀：美國(guó) Bio-Rad 公司；HP100 抽氣型厭氧罐：常州諾基儀器有限公司；BLBIO-5SJ-10SJ-A 發(fā)酵罐：連云港百侖生物；MHY-27766 二氧化碳發(fā)生器：北京美華儀科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 丙酸桿菌培養(yǎng)基

1）乳酸鈉培養(yǎng)基

胰酶水解酪素10 g，酵母提取物5 g，乳酸鈉10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2）葡萄糖培養(yǎng)基

用2%的葡萄糖代替乳酸鈉培養(yǎng)基中的乳酸鈉，其他成分不變，pH 7.0～7.2。

3）脫脂乳粉培養(yǎng)基

脫脂奶粉20g，酵母粉1g，蒸餾水1000mL，pH5.3。

1.3.2 大腸桿菌培養(yǎng)基[5]

酵母膏5 g，蛋白胨10 g，瓊脂1 %～2 %，氯化鈉10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。

1.3.3 沙門氏菌培養(yǎng)基

蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鈉（含12個(gè)結(jié)晶冰）9 g，磷酸二氫鉀 1.5 g，蒸餾水 1 000 mL，靜置10 min，煮沸溶解，調(diào)整 pH（7.0±0.2）。

1.3.4 0.1%的山梨酸鉀溶液

稱取0.1 g 的山梨酸鉀溶解于滅好菌的100 mL 的乳酸鈉培養(yǎng)基混合均勻。

1.4 方法

1.4.1 菌種活化

將斜面保存的費(fèi)氏丙酸桿菌菌株劃線接種于乳酸鈉固體培養(yǎng)基上，于30 ℃厭氧罐中厭氧培養(yǎng)2.5 d。

將斜面保存好的大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌分別接種于LB 液體培養(yǎng)基、7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng) 12 h。

1.4.2 抑菌活性測(cè)定

采用酶標(biāo)法測(cè)定代謝物的抑菌活性[13]。將離心后所得上清液用SLB 培養(yǎng)基溶液進(jìn)行2N梯度稀釋，然后將不同稀釋倍數(shù)的稀釋液分別加入96 孔酶標(biāo)板中，每個(gè)孔的體積為200 μL，其中100 μL 為不同稀釋倍數(shù)的抑菌物質(zhì)，100 μL 為指示菌培養(yǎng)液，并以 100 μL 的SLB 培養(yǎng)基和100 μL 的指示菌培養(yǎng)液作為對(duì)照，制得酶標(biāo)板后將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔在600 nm 處吸光值。當(dāng)測(cè)定的OD 值為對(duì)照組的一半，則代謝產(chǎn)物的稀釋度為一個(gè)抑菌活力單位，單位為 AU/mL[19]。

1.4.3 時(shí)間對(duì)丙酸桿菌抑菌活性影響

將培養(yǎng)好的種子液接入裝有乳酸鈉培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃，厭氧培養(yǎng)2.5 d。將擴(kuò)大培養(yǎng)好的種子液按10%接種量接種至5 L 發(fā)酵罐中，30 ℃，100 r/min，發(fā)酵期間通入CO2使罐壓保持0.05 MPa，控制pH 值為6.0，連續(xù)培養(yǎng)8 d，期間每天取樣測(cè)量菌體干重及發(fā)酵液抑菌活性[20]。以此考察丙酸桿菌抑菌活性隨時(shí)間變化，得到丙酸桿菌抑菌活性最佳培養(yǎng)時(shí)間。

1.4.4 3 種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將活化好的P.freudenreichii CS1420 分別接種于葡萄糖培養(yǎng)基、SLB 培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)1.4.3 試驗(yàn)結(jié)果確定，得到丙酸桿菌代謝物后在5 000 r/min 條件下離心15 min，取其上清液采用“2 倍系列稀釋法”[21]稀釋處理，直至稀釋度為2-8截止。后制其酶標(biāo)板并且每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。對(duì)其抑菌活性進(jìn)行測(cè)定，以考察不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌情況，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

1.4.5 不同接種量培養(yǎng)的得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將丙酸桿菌種子液以4%、5%、6%、7%、8 %的接種量分別接入1.4.4 試驗(yàn)所得的丙酸桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)1.4.3 試驗(yàn)結(jié)果確定。抑菌活性測(cè)定方法同上，以考察不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

1.4.6 不同初始pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物與山梨酸鉀抑菌作用比較

將丙酸桿菌培養(yǎng)基初始pH 值分別設(shè)定為5、5.5、6、6.5、7，5個(gè)梯度分別進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基的類型和接種量的多少根據(jù)1.4.3、1.4.4、1.4.5 的結(jié)果依次確定，抑菌活力測(cè)定方法同上。以考察在不同初始pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性，并與山梨酸鉀抑菌作用比較分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 丙酸桿菌抑菌活性隨時(shí)間變化曲線

發(fā)酵時(shí)間對(duì)丙酸桿菌抑菌活性的影響如圖1所示。

圖1 丙酸桿菌抑菌活性隨時(shí)間變化曲線Fig.1 Curve of antibacterial activity of Propionibacterium with time

由圖1可知，P.freudenreichii CS01 在生長(zhǎng) 24 h 后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，抑菌活力值呈現(xiàn)幾何級(jí)數(shù)增大，在72 h 后抑菌活性值變得緩慢，直到96 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，192 h 后抑菌活力值最大。試驗(yàn)選擇的培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)選擇其菌體穩(wěn)定期，生長(zhǎng)量大，酶系活躍，抑菌活力最佳且代謝旺盛的菌體[22]，因此選取培養(yǎng)時(shí)間為192 h 的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌作用的比較試驗(yàn)。

2.2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

通過酶標(biāo)法所測(cè)定不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性與山梨酸鉀的抑菌情況進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果如圖2、圖3所示。

圖2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性Fig.2 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different culture media on E.coli

圖3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)沙門氏菌的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different media cultures against Salmonella

由圖2、圖3可以看出，試驗(yàn)所選擇的3 種丙酸桿菌培養(yǎng)基（葡萄糖、SLB、脫脂乳）均對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有一定的抑制作用，當(dāng)在SLB 培養(yǎng)基上培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性均能達(dá)到最佳，分別為25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，其抑菌效果優(yōu)于相同條件下的山梨酸鉀。但是在脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性的效果卻不如傳統(tǒng)防腐劑山梨酸鉀。

在脫脂乳培養(yǎng)基培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果不及在SLB、葡萄糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)后所得到的丙酸桿菌代謝物和傳統(tǒng)防腐劑山梨酸鉀對(duì)指示菌的抑制效果，抑菌活性分別為13.6 AU/mL 和10.9 AU/mL。其可能原因是由于脫脂乳培養(yǎng)基本身的初始pH 值就比較低，再加上丙酸桿菌在生長(zhǎng)過程中也會(huì)產(chǎn)生丙酸、乙酸等有機(jī)酸[23]，致使丙酸桿菌在脫脂乳培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度較為緩慢，代謝產(chǎn)物生產(chǎn)量少，故相較其他兩種培養(yǎng)基所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)指示菌的抑制效果也不太理想。

因此，從數(shù)據(jù)分析比較來看，實(shí)際生產(chǎn)中可選擇SLB 培養(yǎng)基或者葡萄糖培養(yǎng)基對(duì)丙酸桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，所得其代謝產(chǎn)物丙酸桿菌素對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果要優(yōu)于0.1%的山梨酸鉀。

2.3 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

通過酶標(biāo)法所測(cè)定不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物，對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性與山梨酸鉀的抑菌情況進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性Fig.4 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against E.coli

圖5 不同接種量培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)沙門氏菌的抑菌活性Fig.5 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different inoculum cultures against Salmonella

由圖4、5 可以看出，接種量的多少對(duì)丙酸桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果還是有一定的影響。比較之下接種量為5%培養(yǎng)發(fā)酵后所得的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌活性均能達(dá)到最佳，分別為28.8 AU/mL 和18.1 AU/mL，其抑菌效果優(yōu)于相同條件下的山梨酸鉀。但是通過增大其接種量，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活性呈下降趨勢(shì)，當(dāng)接種量為8%時(shí)其抑菌活性分別僅為16.2 AU/mL 和10.5 AU/mL，比較于山梨酸鉀的21.1 AU/mL 和14.0 AU/mL，其抑菌效果要差于山梨酸鉀對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果。其原因可能是因?yàn)殡m然增大其接種量可以縮短延滯期，加快菌體的生成，使得產(chǎn)物形成期得以提前；但是也并非接種量越大越好，接種量的過大會(huì)導(dǎo)致其菌體生長(zhǎng)速度過于快速，也較早的消耗培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分，使得培養(yǎng)后期菌體得不到充足的營(yíng)養(yǎng)而造成培養(yǎng)基粘度增大等一系列不良變化[2]。

因此生產(chǎn)中應(yīng)選用接種量為5%或6%時(shí)其抑菌效果要優(yōu)于0.1%的山梨酸鉀，更能達(dá)到對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑制效果。

2.4 不同初始培養(yǎng)pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較

不同初始培養(yǎng)pH 值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌作用與山梨酸鉀的比較，結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 不同初始pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性Fig.6 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites cultured at different initial pH values against E.coli

圖7 不同初始pH值培養(yǎng)得到的丙酸桿菌代謝物對(duì)沙門氏菌的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of Propionibacterium metabolites obtained from different initial pH values on Salmonella

由圖6、圖7可以看出，初始pH 值的不同對(duì)沙門氏菌的抑菌效果差距較為明顯，而對(duì)大腸桿菌的抑制效果差距相差不大。對(duì)于大腸桿菌來說，在pH 值為5.5、6、6.5 時(shí)其抑菌活性分別為 27.5、26.1 AU/mL 和26.9 AU/mL。由此可見pH 值為5.5～6.5 之間，比于0.1%的山梨酸鉀抑菌活性值為21.1 AU/mL，丙酸桿菌代謝物對(duì)大腸桿菌抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀。生產(chǎn)中選用初始pH 值為6.5 時(shí)能達(dá)到較好的抑菌效果。

當(dāng)選擇初始pH 值為5 時(shí)，培養(yǎng)后的丙酸桿菌代謝物無法利用酶標(biāo)法計(jì)算其對(duì)沙門氏菌的抑菌活性，在 pH 值為 5.5、6、6.5、7 時(shí)其抑菌活性分別為 12.1、14.5、7.9 AU/mL 和 14.1 AU/mL。由此可見 pH 值為 6時(shí)，丙酸桿菌代謝物對(duì)沙門氏菌有很好的抑菌效果。相比于山梨酸鉀抑菌活性值為14.1 AU/mL，0.1%的山梨酸鉀抑菌效果與丙酸桿菌素對(duì)沙門氏菌的抑制效果相差不大。

3 結(jié)論

改變丙酸桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)pH 值、接種量3個(gè)方面進(jìn)行研究，再與0.1%的山梨酸鉀抑菌作用進(jìn)行一定的比較分析后：

1）從費(fèi)氏丙酸桿菌生長(zhǎng)抑菌活性隨時(shí)間變化試驗(yàn)可知，在第192 h 抑菌值最佳。因此選取培養(yǎng)時(shí)間為第192 h 的發(fā)酵液進(jìn)行抑菌作用的比較試驗(yàn)。

2）從選擇的葡萄糖、SLB、脫脂乳3 種丙酸桿菌培養(yǎng)基來看，在SLB 培養(yǎng)基發(fā)酵得到的丙酸桿菌素均對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌抑菌活力達(dá)到最佳值分別為25.3 AU/mL 和18.3 AU/mL，相比較的山梨酸鉀的抑菌活性為21.1、14.1 AU/mL，可見其抑菌活性較優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀，但是丙酸桿菌在脫脂乳培養(yǎng)基上后所得到丙酸桿菌素的抑制效果卻不及傳統(tǒng)的山梨酸鉀。

3）對(duì)于接種量而言，選擇SLB 培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后，結(jié)果表明丙酸桿菌代謝物接種量為5%或6%時(shí)其大腸桿菌抑菌活力值均能達(dá)到28.1 AU/mL，其抑菌效果要優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀。對(duì)于沙門氏菌而言，接種量為5%時(shí)沙門氏菌抑菌活力值達(dá)到18.0 AU/mL，其抑菌效果會(huì)優(yōu)于傳統(tǒng)的山梨酸鉀；對(duì)于接種量為8%時(shí)對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果要不及山梨酸鉀。

4）對(duì)于不同初始pH 值而言，同樣選擇SLB 作為其發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為5%后，結(jié)果表明丙酸桿菌代謝物初始培養(yǎng)pH 值為6.5 時(shí)其抑菌活性對(duì)大腸桿菌所產(chǎn)生抑菌效果最佳值為26.9 AU/mL，初始培養(yǎng)pH值為6 時(shí)其抑菌活性對(duì)沙門氏菌所產(chǎn)生抑菌效果最佳值為14.5 AU/mL。與0.1%的山梨酸鉀的抑菌效果相比較而言，其對(duì)沙門氏菌的抑菌效果與丙酸桿菌代謝物抑菌效果相當(dāng)，生產(chǎn)中選用初始pH 值為6 時(shí)也能達(dá)到較好的抑制效果。