胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)的修飾作用

夏民權(quán)，陳銀霞，張丹，孫衛(wèi)青

（1.長江大學(xué)食品加工與安全系，湖北 荊州 434025；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系，湖北 武漢 430070；3.長江大學(xué)食品科學(xué)與工程系，湖北 荊州 434025；4.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

肌原纖維蛋白是豬肉的骨架蛋白，占豬肉總蛋白質(zhì)的50%～55%[1]。其特性在肉品的嫩度和多汁性中起著決定性的作用[2]。目前，肌原纖維蛋白凝膠的修飾作用日益成為在肉蛋白研究中最為熱門的話題之一，其中很大一部分研究集中在氧化修飾作用對肌原纖維蛋白凝膠的影響上，氧化劑的選擇決定其氧化類型的生成[3-4]。也有一部分研究把關(guān)注焦點(diǎn)放在抗氧化劑的添加在肌原纖維蛋白凝膠的氧化還原修飾上[5-6]。另一部分則集中在天然生物大分子的添加對肌原纖維蛋白的修飾作用上，如多糖[7-8]，草本植物提取物[9]等。

基于對添加物和蛋白提取物純體系的研究，考慮到蔬菜和肉品作為人們營養(yǎng)物質(zhì)的基本來源，以及胡蘿卜富含多種天然維生素，礦物質(zhì)等，與肌肉在營養(yǎng)成分上形成有利的互補(bǔ)。因此，本研究選擇豬里脊肉和胡蘿卜為主要原料，分離提取肌原纖維蛋白和胡蘿卜汁，擬向肌原纖維蛋白中添加不同含量的胡蘿卜汁（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL每2mL protein），并分別對其進(jìn)行了凝膠色度，凝膠保水性（water holding capacity，WHC），凝膠流變性，及差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析，旨在探究胡蘿卜汁的添加對肌原纖維蛋白凝膠的修飾作用，為健康的肉制品的研發(fā)提供依據(jù)和基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬里脊肉、胡蘿卜：湖北省荊州市荊州區(qū)中百倉儲，里脊肉經(jīng)宰后分裝，置于4 ℃冰箱48 h 內(nèi)保鮮備用；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸（Ethylenebis（oxyethylenenitrilo）tetraacetic acid，EGTA）、氯化鎂、濃鹽酸、甲醇、標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白、氧氧化鈉、五水硫酸銅，濃氨水（以上藥品均為分析純）：國藥集化學(xué)有限公司。

BSA224S 電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；IKA T25 高速均質(zhì)機(jī)：德國 IKA 公司；X-30R 冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計：梅特勒托利多儀器有限公司；Vortex Genie 多用途渦旋混合器：美國Scientific Industries 公司；UV-2450 紫外可見分光光度計：日本島津公司；Discovery DHR-1 流變儀：美國 TA 公司；DSC 差式熱掃描儀：瑞士Mettler-Toledo 公司；CR-400 便攜式色差儀：柯尼達(dá)美能達(dá)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豬里脊肉中肌原纖維蛋白的提取

參考吳滿剛等[10-11]的方法，取鮮嫩豬里脊肉，去除脂肪和結(jié)締組織，用刀剁成1 cm3左右大小的方塊，放入高速組織搗碎機(jī)里絞碎，均勻分裝在50 mL 的離心管中，加入4 倍體積的磷酸緩沖液（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L NaH2PO4/Na2HPO4，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，pH 7.0）冰水浴勻漿 60 s，同時，除去剩下的結(jié)締組織，4 ℃，4 290 r/min 離心 15 min，取沉淀重復(fù)上面步驟2 次。得到沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl 溶液，用紗布過濾后，4 ℃，4 290 r/min 離心 15 min，重復(fù)此操作兩遍，沉淀即為粗肌原纖維蛋白，4 ℃冷藏備用，48 h 內(nèi)用完。

1.2.2 雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量

參考張厚鋒[12]和劉燕等[13]等的方法，并稍作修改。

雙縮脲試劑配制：稱取1.5 g 硫酸銅和6 g 酒石酸鉀鈉，用500 mL 水溶解，邊攪拌邊加入300 mL 10 %NaOH 溶液，用水稀至1 L，貯存于塑料試劑瓶中，若瓶中有沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）配制成10 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用BSA 溶液濃度1 mg/mL 的280 nm 處的吸光度為0.66 來校正其純度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)備 6 支試管依次加入：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL BSA 溶液，用蒸餾水補(bǔ)充到 1 mL。加入4 mL 雙縮脲試劑，在25 ℃水浴條件下水浴30 min。在540 nm 波長光測定吸光度值，重復(fù)3 次。以3 組的平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：準(zhǔn)備5 支試管，2 支試管加入1 mL 磷酸緩沖液，另外3 支加入1 mL 待測蛋白樣品，加入4 mL 雙縮脲試劑，25 ℃水浴 30 min，540 nm 波長光測定吸光值。因?yàn)闃悠窛舛炔荒艹^10 mg/mL，故測定時需配制適當(dāng)濃度蛋白混合液進(jìn)行測定。

以蛋白濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），以吸光度為縱坐標(biāo)（Abs），通過Excel 分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程：Y=0.514 6x+0.004，R2=0.999 1，發(fā)現(xiàn)線性關(guān)系良好，可以用于本試驗(yàn)的定量分析。

1.2.3 胡蘿卜汁-肌原纖維蛋白凝膠的制備

稱取25 g 胡蘿卜加水榨汁250 mL，粗胡蘿卜汁的濃度為200 mg/mL（相對于胡蘿卜不加水榨汁而言）。先將肌原纖維蛋白溶于適量的磷酸緩沖液（0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 6.0），取 2 mL蛋白依次加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 的胡蘿卜汁于10 mL 的離心管中，加水使混合物為4.5 mL，調(diào)整蛋白濃度約為30 mg/mL，依次編號。蛋白混合物需攪拌5 min 以使蛋白混合均勻。凝膠制備方法參考Zhou等[14]的方法，4 ℃冰箱中靜置6 h 后，置于水浴鍋中，以大約 1 ℃/min 的速率從 20 ℃線性升溫到 70 ℃，在 70 ℃保溫20 min 后，將離心管迅速取出，放在冰水中迅速冷卻，然后置于4 ℃冰箱冷卻過夜，第二天進(jìn)行樣品指標(biāo)測試。

1.2.4 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠色度的影響

參照楊雪紅[15]的方法并作修改，將冰箱中制好的蛋白質(zhì)凝膠取出，平衡到室溫，用刀橫向切出5 mm 的圓柱薄片（兩面需平整），室溫下，用色度儀測出樣品的L、a、b 值。白度值（W）和彩度值（C）用下面公式計算：

式中：L 為樣品的亮度；a 為紅綠值；b 為黃藍(lán)值。

1.2.5 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

參照Chen 等[16]的方法并做修改，先稱離心管重W，將制好的凝膠放入離心管中，稱其重量M，然后4 ℃，8 000 r/min，離心 10 min，倒出水分后，稱其質(zhì)量m。保水性用下面公式計算：

1.2.6 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠流變性的影響

參考彭曉蓓等[17]和余振宇等[18]的方法，通過使用錐板型流變儀測定肌原纖維蛋白在不同剪切速率下的剪切應(yīng)力變化。流變儀參數(shù)設(shè)置如下：夾具為50 mm錐轉(zhuǎn)子，狹縫為1.0 mm。所有樣品進(jìn)行3 次平行測定。

1.2.7 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠DSC 變化的影響

方法參考Yao 等[19]和劉長姣等[20]的方法并做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，取樣品約100 mg 加入鋁坩堝中，密封。取一個空鋁坩堝作為參照，所有樣品從25 ℃～160 ℃以5 ℃/min的速率進(jìn)行掃描。每個處理進(jìn)行3 次重復(fù)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上試驗(yàn)，每組樣品均進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，采用Excel 計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，并用Excel 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠色度的影響

胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠色度的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠色度的影響Fig.1 Effect of carrot juice on the colorimetry of myofibrillar proteins gel

隨著胡蘿卜汁的添加量的增加，肌原纖維蛋白凝膠的白度值逐漸降低，彩度值逐漸增加，這很大一部分是因?yàn)楹}卜汁本身自帶的顏色，也可能是因?yàn)楹}卜汁的某些成分與蛋白質(zhì)結(jié)合，結(jié)合越緊密，顏色越深。這一結(jié)果可能對肉制品在蒸煮過程中的色素?fù)p失，有一定的彌補(bǔ)作用。

2.2 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響如圖2所示。

圖2 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of carrot juice on WHC of myofibrillar proteins gel

與空白組相比，隨著胡蘿卜汁的添加量的增加，當(dāng)體系中的胡蘿汁的量低于1.5 mL 時，凝膠的保水性是逐漸增加的，當(dāng)超過1.5 mL 時，保水性逐漸變差。兩個因素直接影響著凝膠的保水性：一是給水分的存留留出足夠的空間，二是存留水分的作用力足夠大[21]。本試驗(yàn)中，當(dāng)胡蘿卜汁的量低于1.5 mL 時，胡蘿卜汁可能對凝膠形成良好的網(wǎng)狀空間結(jié)構(gòu)有著直接的促進(jìn)作用，也可能存在某些帶電荷的離子附著在凝膠上，使其對水的吸附力增加，從而導(dǎo)致其保水性增加。當(dāng)樣品中的胡蘿卜汁的量超過1.5 mL 時，過量的胡蘿卜汁可能填充了凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使其持水空間縮小，也可能是因?yàn)槟z微觀結(jié)構(gòu)的改變，使疏水基團(tuán)的過度暴露而導(dǎo)致保水性的降低，這一結(jié)果與張慧蕓等[22]的研究結(jié)果相似。

2.3 胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠流變性的影響

胡蘿卜汁對肌原纖維蛋白凝膠流變性的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠最大剪切應(yīng)力的影響Fig.3 Effect of carrot juice on maximum shear stress of myofibrillar proteins gel

由圖3所知，隨胡蘿卜汁的量的增加，凝膠的最大剪切應(yīng)力逐漸減小，且當(dāng)胡蘿卜汁超過2 mL 時，最大剪切力急劇下降。

圖4為肌原纖維蛋白凝膠的最大黏度隨胡蘿卜汁的添加量的增加的變化情況，其變化趨勢類似于最大剪切應(yīng)力。

由圖4可知，蛋白質(zhì)的剪切應(yīng)力和黏度變化能間接反映蛋白質(zhì)凝膠分子之間的相互作用力，二硫鍵和疏水作用的大小和穩(wěn)定性[23]。由此，可以推斷出，胡蘿卜汁中的某些還原性物質(zhì)，能還原二硫鍵，而導(dǎo)致分子間通過二硫鍵結(jié)合的作用力降低，也有可能是胡蘿卜汁中的某些帶電荷的分子，附著在肌原纖維蛋白凝膠的表面，導(dǎo)致其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其疏水基團(tuán)的暴露增加，而導(dǎo)致凝膠分子間的作用力的穩(wěn)定性降低，從而隨胡蘿卜汁添加量的增加，肌原纖維蛋白凝膠的最大剪切應(yīng)力和最大黏度值表現(xiàn)出下降的趨勢。

圖4 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠最大黏度的影響Fig.4 Effect of carrot juice on maximum viscosity of myofibrillar proteins gel

2.4 肌原纖維蛋白凝膠DSC掃描

肌原纖維蛋白凝膠DSC 掃描結(jié)果如圖5所示。

圖5 肌原纖維蛋白凝膠DSC掃描圖譜Fig.5 DSC scanning atlas of myofibrillar proteins gel

肌原纖維蛋白凝膠的DSC 掃描的整個過程表現(xiàn)出放熱趨勢。分析表1和表2的數(shù)據(jù)可以得出，隨胡蘿卜汁的量的增加，凝膠外推起始溫度（Teo）和凝膠熔點(diǎn)（Tm）先增加后減少，在1.5 mL 添加量時，Teo最大為102.3 ℃，Tm最大為 125.8 ℃；焓值（Hm）則表現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢；凝膠玻璃態(tài)轉(zhuǎn)變溫度（Tg）在2.0 mL 胡蘿卜汁的添加量時，有最大值為143.8 ℃。熱轉(zhuǎn)變溫度能反映肌原纖維蛋白凝膠在溫度變化過程中的有關(guān)信息的變化情況，如蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化、熱穩(wěn)定性、熱變性動力學(xué)、熱變性的原因等[24]。當(dāng)胡蘿卜汁的添加量少于1.5 mL 時，Teo和Tm的增加，可能是因?yàn)榈蜐舛认?，胡蘿卜汁直接促進(jìn)了蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，也可能是因?yàn)楹}卜汁中某些帶電荷分子的附著，使凝膠分子間的作用力增強(qiáng)，使其熱穩(wěn)定性增加，也有可能與形成了熱穩(wěn)定性更好的復(fù)合物有關(guān)[25]。而當(dāng)胡蘿卜汁的濃度超過1.5 mL 時，過量的胡蘿卜汁填充了肌原纖維蛋白凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也可能是凝膠表面電荷量的過量增加，導(dǎo)致其微觀結(jié)構(gòu)改變疏水基團(tuán)暴露，疏水性增加，從而使穩(wěn)定性降低，這一結(jié)果與上述保水性的結(jié)論一致。焓值反應(yīng)了整個升溫過程中，凝膠體系的整體熱量變化。Tg反映出蛋白質(zhì)凝膠相轉(zhuǎn)變需要的溫度，間接反映了蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性，Tg越大，凝膠體系越穩(wěn)定?？傮w來說，當(dāng)胡蘿卜汁的添加量為1.5 mL 時，凝膠的熱穩(wěn)定狀態(tài)是最佳的。

表1 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠熔點(diǎn)（熱焓）的影響Table 1 Effect of carrot juice on the melting point（heat enthalpy）of myofibrillar proteins gel

表2 胡蘿卜汁添加量對肌原纖維蛋白凝膠轉(zhuǎn)變溫度的影響Table 2 Effect of carrot juice on the transformation temperature of myofibrillar proteins gel

3 結(jié)論

本研究選擇胡蘿卜和豬里脊肉為試驗(yàn)原材料，分離提取肌原纖維蛋白和胡蘿卜汁，探究不同的胡蘿卜汁的添加量對肌原纖維蛋白凝膠性質(zhì)修飾作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著胡蘿卜汁添加量的增加，凝膠白度值下降，彩度值上升，整體色度趨向于亮橙色，有利于彌補(bǔ)肉品在蒸煮過程中的色度的損失；保水性對胡蘿卜汁的劑量依賴關(guān)系，表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，結(jié)合不同比例的胡蘿卜汁-肌原纖維蛋白凝膠的最大剪切應(yīng)力和最大黏度值的變化，以及DSC 的結(jié)果，整體反映出當(dāng)胡蘿卜汁的添加量為1.5 mL 時，肌原纖維蛋白凝膠的熱穩(wěn)定性以及保水性和凝膠品質(zhì)相對較好。