姜黃素調(diào)節(jié)miR-133a表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

袁洪波,孟佩盈,戚柳杰

袁洪波,孟佩盈,戚柳杰,諸暨市中心醫(yī)院內(nèi)二科 浙江省諸暨市311800

核心提要：姜黃素可抑制肝癌SMCC-7721細(xì)胞活力、侵襲和遷移,同時(shí)上調(diào)miR-133a表達(dá);采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染miR-133a模擬物上調(diào)miR-133a表達(dá)后,SMCC-7721細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯減弱,并能夠與姜黃素協(xié)調(diào)起到抑制SMCC-7721細(xì)胞侵襲和遷移的作用.

0 引言

有“癌中之王”之稱的肝癌是臨床上最為常見的惡性腫瘤,術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響肝癌治療的重要因素,如何抑制肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提高患者的生存率是臨床上的一大難題.除傳統(tǒng)的手術(shù)治療外,放療和化療的治療并不理想,往往會(huì)伴有毒副作用的產(chǎn)生,慢慢地安全有效的中藥及其成分逐漸進(jìn)入人們的視野.姜黃素是一種具有抗氧化、抗炎、降血脂和抗腫瘤等活性的多酚類化合物,其抗腫瘤的作用備受學(xué)者們的關(guān)注.越來越多的研究[1-3]發(fā)現(xiàn),姜黃素對(duì)胃癌、食管癌和乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均具有較好的抑制作用.近年來有研究[4]報(bào)道,姜黃素可通過調(diào)控miR-133a表達(dá)干預(yù)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移.研究[5,6]已證實(shí),miR-133a在肝癌中低表達(dá),姜黃素可抑制肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移,但其有無調(diào)控miR-133a表達(dá)發(fā)揮抗腫瘤的作用并不清楚.因此,本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)旨在探討miR-133a在姜黃素抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系SMMC-7721和正常肝細(xì)胞系LO2購于中科院上海細(xì)胞庫.RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,人工基底膜Matrigel、MTT試劑和姜黃素均購于美國Sigma公司,Trizol試劑購于美國LIFE公司,miR-133a模擬物及陰性對(duì)照購自上海吉瑪公司.逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于大連寶生物公司,Transwell小室(孔徑8 μm)購于美國Coster公司.

1.2 方法

并購動(dòng)因：蒙牛一直以來都處于與伊利的競爭不相上下的狀態(tài)，但在2012年，蒙牛的銷售收入比伊利低了60多個(gè)億，這是自企業(yè)成立以來第一次營業(yè)收入下跌，對(duì)蒙牛的打擊無可厚非。蒙牛發(fā)現(xiàn)了嬰幼兒奶粉這一系列產(chǎn)品方面是自己的短板，而伊利在當(dāng)年已經(jīng)開始取得成績。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：采用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基,在5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)SMMC-7721和LO2細(xì)胞.定期觀察,每3 d換液一次.當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)85%以上時(shí),加入0.25%胰蛋白酶消化傳代.收集對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 RT-PCR檢測：在收集到的SMMC-7721和LO2細(xì)胞中加入Trizol試劑提取總RNA,并采用紫外分光光度計(jì)測定總RNA的濃度.以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后,以此為模板配置20 μL反應(yīng)體系,上PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增.反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min,(95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s)×35個(gè)循環(huán).其中,miR-133a(上游：5'-GCCAAGCTGGTAAA-ATGGAA-3'和下游：5'-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3')和內(nèi)參U6(上游：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和下游：5'-AACGCTTCACGAATTTGCG-3')引物序列由上海生工生物合成.以2－△△CT法計(jì)算SMMC-7721和LO2細(xì)胞中miR-133a的相對(duì)表達(dá)量.

1.2.3 MTT檢測：取96孔細(xì)胞板,將對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞以每孔200 μL(細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL)進(jìn)行接種.置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,次日將細(xì)胞隨機(jī)分為三組：對(duì)照組(0 μmol/L姜黃素)、10 μmol/L姜黃素處理組和20 μmol/L姜黃素處理組.另設(shè)無細(xì)胞的空白組.按照分組,分別給藥處理.48 h后,每孔中加入20 μL MTT溶液,于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后,加入二甲基亞砜震蕩反應(yīng)至紫色結(jié)晶完全溶解.采用酶標(biāo)儀選用490 nm檢測波長檢測各孔的吸光度值,根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=100%×(藥物處理組OD值-空白組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白組OD值)計(jì)算SMMC-7721細(xì)胞的存活率.并采用RT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-133a的相對(duì)表達(dá)水平.

1.2.4 Transwell小室檢測：收集上述對(duì)照組和20 μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞,以胰蛋白酶消化,加無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：取Transwell小室,于上室中加入200 μL制備的對(duì)照組和20 μmol/L姜黃素處理組細(xì)胞懸液,下室中加入600 μL含血清的RPMI1640培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,取出小室,以磷酸緩沖液洗滌后,小心擦去上室的細(xì)胞.以甲醛于4 ℃下固定15 min,磷酸緩沖液洗滌后,再以結(jié)晶紫染色30 min.以磷酸緩沖液洗滌后,晾干.于倒置顯微鏡下,選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞的個(gè)數(shù)即侵襲細(xì)胞數(shù),并拍照,結(jié)果以均值表示.細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：首先以Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室,風(fēng)干成膠后,以無血清的培養(yǎng)基封閉30 min,其他操作均與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取6孔細(xì)胞板,以每孔2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種.置于孵箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)85%以上時(shí),進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染.實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為陰性對(duì)照(miR-NC)組和miR-133a組,根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書步驟分別將miR-NC和miR-133a模擬物轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞中,孵育6 h后,換液繼續(xù)培養(yǎng).培養(yǎng)48 h后,檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲情況.另取一個(gè)6孔細(xì)胞板,以每孔2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行接種,置于孵箱中常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞密度達(dá)85%以上時(shí),進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染.將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(未做任何處理)、姜黃素組(以20 μmol/L姜黃素處理48 h)、姜黃素+陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染miR-NC后,以20 μmol/L姜黃素處理48 h)和姜黃素+miR-133a組(轉(zhuǎn)染miR-133a模擬物后,以20 μM姜黃素處理48 h).按照如上分組分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染和姜黃素處理后,檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲情況.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以mean±SD形式表示,采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,三組組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,方差齊性采用SNK-q檢驗(yàn),兩組組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn).P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的活力 姜黃素(0、10、20 μmol/L) 處理48 h,MTT檢測細(xì)胞活力,結(jié)果見圖1.與對(duì)照組(0 μmol/L)相比,10、20 μmol/L姜黃素處理組的細(xì)胞存活率均明顯降低(P＜0.05),且在20 μmol/L姜黃素作用下SMMC-7721細(xì)胞活力的抑制效果最強(qiáng).

2.2 姜黃素抑制SMCC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲 采用Transwell小室分別檢測20 μmol/L姜黃素處理后,SMMC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化,結(jié)果見圖2.與對(duì)照組相比,姜黃素處理后,SMMC-7721細(xì)胞的遷移個(gè)數(shù)和侵襲個(gè)數(shù)均明顯減少(P＜0.05).

2.3 姜黃素促進(jìn)肝癌SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a的表達(dá) RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),肝癌SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平較正常肝LO2細(xì)胞明顯降低(P＜0.05),見圖3A.然而,以10、20 μmol/L姜黃素處理48 h后,SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平呈濃度依賴性升高(P＜0.05),見圖3B.

圖1 不同濃度的姜黃素對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞活力的影響.aP＜0.05,與0 μmol/L組相比.

圖2 姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的影響.A：細(xì)胞遷移結(jié)果;B：細(xì)胞侵襲結(jié)果.aP＜0.05,與對(duì)照組相比.放大倍數(shù)：200 ×.

圖3 姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a表達(dá)的影響.A：正常肝LO2細(xì)胞和肝癌SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a表達(dá),aP＜0.05,與LO2細(xì)胞相比;B：姜黃素處理后,SMCC-7721細(xì)胞中miR-133a表達(dá),cP＜0.05,與0 μmol/L組相比.

圖4 miR-133a過表達(dá)對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響.A：細(xì)胞遷移結(jié)果;B：細(xì)胞侵襲結(jié)果.aP＜0.05,與陰性對(duì)照組相比.放大倍數(shù)：200 ×.

圖5 miR-133a過表達(dá)對(duì)姜黃素作用下SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的影響.A：細(xì)胞遷移結(jié)果;B：細(xì)胞侵襲結(jié)果.aP＜0.05,與姜黃素組相比;cP＜0.05,與姜黃素+陰性對(duì)照組相比.

2.4 miR-133a過表達(dá)抑制SMCC-7721的遷移和侵襲 采用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-133a模擬物48 h后,以Transwell小室檢測SMCC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力,結(jié)果見圖4.與陰性對(duì)照組相比,miR-133a組細(xì)胞的遷移個(gè)數(shù)和侵襲個(gè)數(shù)均明顯減弱(P＜0.05).

2.5 miR-133a過表達(dá)增強(qiáng)姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用 采用Transwell小室進(jìn)一步檢測miR-133a過表達(dá)對(duì)姜黃素作用下SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的影響,結(jié)果見圖5.20 μmol/L姜黃素處理后,SMCC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯減弱,轉(zhuǎn)染miR-NC未能影響姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞的作用(P＞0.05),但轉(zhuǎn)染miR-133a模擬物后,姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用明顯增強(qiáng)(P＜0.05).

3 討論

肝癌是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著人們的身體健康和生活質(zhì)量.目前,肝癌的治療仍以手術(shù)治療、放療和化療為主.隨著醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展,肝癌患者的總生存率雖有所提高,但肝癌的治療并未得到根本改善,肝癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)率仍較高[7,8].如何安全有效的防治腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移對(duì)肝癌患者的治療尤為重要.因中藥具有毒性小、效率高和價(jià)格低等優(yōu)勢,中藥抗腫瘤逐漸成為研究的熱點(diǎn).姜黃素是從中藥姜黃根莖中提取的一種活性成分,已被證實(shí)在前列腺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌中具有可喜的抗腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[9-11].目前,關(guān)于姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用已有報(bào)道.例如：Zhang等[12]研究指出,姜黃素能夠增強(qiáng)二甲雙胍對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成的抑制作用;邱偉等[13]報(bào)道證實(shí),姜黃素可通過下調(diào)MMP-2/9和COX-2的表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲.但是,姜黃素應(yīng)用于臨床治療肝癌的理論依據(jù)還不夠充分.因此,探討姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)姜黃素臨床治療肝癌具有重要意義.

大量研究[14-18]顯示,miRNAs與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切,在腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用.如：miR-23b-3p在肝癌細(xì)胞中低表達(dá),與肝癌進(jìn)展和復(fù)發(fā)時(shí)間關(guān)系密切[17];miR-1260b在肝癌組織中高表達(dá),miR-1260b的過度表達(dá)增加了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲[18].miR-133a作為miRNAs家族成員,在乳腺癌、胃癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中異常低表達(dá),與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存時(shí)間密切相關(guān),上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[19-21].有研究[4]報(bào)道,姜黃素可通過調(diào)控miR-133a表達(dá)干預(yù)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移.已有研究[22,23]證實(shí),miR-133a在肝癌中低表達(dá),姜黃素可抑制肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移,但其有無通過調(diào)控miR-133a表達(dá)來發(fā)揮作用并不清楚.本研究以姜黃素處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),細(xì)胞活力、遷移和侵襲能力均明顯受到抑制,這與之前研究[23]的研究結(jié)果相吻合.進(jìn)一步觀察姜黃素對(duì)肝癌細(xì)胞中miR-133a表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn),miR-133a表達(dá)呈濃度依賴性升高.提示,姜黃素可能通過上調(diào)miR-133a參與抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的調(diào)控過程.為了驗(yàn)證這一猜想,本研究通過轉(zhuǎn)染miR-133a模擬物上調(diào)SMMC-7721細(xì)胞中miR-133a表達(dá)后,檢測發(fā)現(xiàn)SMMC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著減弱.該結(jié)果與miR-133a在胃癌和非小細(xì)胞肺癌中的抑癌作用相吻合[20,21].這提示,miR-133a在肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要的抑制作用.同時(shí)發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-133a表達(dá)還能增強(qiáng)姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用.結(jié)果表明,姜黃素可通過上調(diào)miR-133a表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲.

總之,miR-133a表達(dá)上調(diào)是姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制,為姜黃素介導(dǎo)miRNAs發(fā)揮抗腫瘤作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).后期我們會(huì)進(jìn)一步探討姜黃素是如何通過上調(diào)miR-133a表達(dá)調(diào)控下游相關(guān)基因參與其抗肝癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控,以期為姜黃素臨床治療肝癌提供新的參考依據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

姜黃素對(duì)包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展表現(xiàn)出較好的抑制作用,但其抗肝癌的作用機(jī)制尚不完全清晰.有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素可通過調(diào)控miR-133a表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移;miR-133a在肝癌中低表達(dá)的結(jié)果已有數(shù)據(jù)證實(shí),但姜黃素是否介導(dǎo)miR-133a表達(dá)發(fā)揮抗肝癌的作用并不清楚.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究旨在探討miR-133a在姜黃素抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中的作用,以期為姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

探討姜黃素調(diào)節(jié)miR-133a表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響,以期姜黃素抗肝癌細(xì)胞的機(jī)制提供新線索.

實(shí)驗(yàn)方法

以10、20 μmol/L姜黃素處理肝癌SMMC-7721細(xì)胞48 h后,采用MTT法檢測細(xì)胞活力,Transwell小室檢測細(xì)胞的遷移和侵襲;RT-PCR檢測細(xì)胞中miR-133a表達(dá).采用RT-PCR檢測正常肝LO2細(xì)胞和肝癌SMMC-7721細(xì)胞中miR-133a表達(dá);采用脂質(zhì)體法將miR-133a模擬物轉(zhuǎn)染至SMMC-7721細(xì)胞后,Transwell小室檢測姜黃素作用前后細(xì)胞遷移和侵襲.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

姜黃素可抑制SMMC-7721細(xì)胞活力、遷移和侵襲,上調(diào)miR-133a表達(dá).miR-133a在SMCC-7721細(xì)胞中的表達(dá)水平較LO2細(xì)胞明顯降低.上調(diào)miR-133a表達(dá)后,SMCC-7721細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯減弱,同時(shí)可增強(qiáng)姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

姜黃素可上調(diào)miR-133a表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲.這一結(jié)果進(jìn)一步揭示了姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,也為姜黃素抗肝癌的發(fā)生發(fā)展提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

展望前景

本研究僅僅發(fā)現(xiàn)miR-133a表達(dá)上調(diào)是姜黃素抗肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制,但miR-133a是如何調(diào)控下游相關(guān)基因參與姜黃素抗肝癌轉(zhuǎn)移的還有待深入探討,后期我們將繼續(xù)致力于這方面的研究,以期為姜黃素臨床治療肝癌提供新依據(jù).