微生物β-甘露聚糖酶的研究進(jìn)展

張建新，宋宜樂，馮軍廠，常緒路*

（河南師范大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007）

β-甘露聚糖酶在動(dòng)物生產(chǎn)、飼料、食品、醫(yī)藥、石油開采及生物技術(shù)等方面廣泛應(yīng)用[1]，有關(guān)β-甘露聚糖酶的最初報(bào)道可以追溯至20世紀(jì)初到20世紀(jì)50年代[2]，1960年研究學(xué)者DOETSEH等論述了能產(chǎn)β-甘露聚糖酶的細(xì)菌，之后到1965年，SHIBATA闡述了β-甘露聚糖酶的界定，為日后有關(guān)內(nèi)容的研討提供了理論依據(jù)[3-5]。70年代后，學(xué)者又進(jìn)行了大量產(chǎn)β-甘露聚糖酶菌種的挑選、培育誘導(dǎo)，考察培養(yǎng)基對(duì)菌種產(chǎn)酶的影響。根據(jù)多年來大致的統(tǒng)計(jì)已有100余種能產(chǎn)此酶的微生物，探究最多的有細(xì)菌屬的芽孢桿菌、枯草桿菌；真菌屬的木霉菌、放線菌等。后來，人們進(jìn)一步對(duì)不同來源的β-甘露聚糖酶進(jìn)行純化處理，對(duì)該酶的基礎(chǔ)特性有了新的認(rèn)識(shí)。

β-甘露聚糖酶不但是內(nèi)切水解酶還是胞外誘導(dǎo)酶，其能被水解底物誘導(dǎo)，從而催化甘露多糖、異甘露多糖降解[1-4]；還可將這些糖類中的β-1,4-甘露糖苷鍵降解，分解成甘露寡糖。除此之外，在含有纖維素成分原料的分解過程中β-甘露聚糖酶也有應(yīng)用，已經(jīng)在生物制膠、食物增甜劑、織物、水產(chǎn)動(dòng)物日糧、醫(yī)學(xué)藥物、工具酶、石油開采等行業(yè)中有著相當(dāng)廣泛的應(yīng)用[5]。

1 甘露聚糖

甘露聚糖是半纖維素（hemicellulose）中含量僅次于木聚糖的第二大復(fù)合物[6]，它以β-1,4-糖苷鍵鏈接構(gòu)成主鏈的基本骨架，由半乳糖、葡萄糖等以α/β-1,6-糖苷鍵鏈接成支鏈[7-9]。根據(jù)其構(gòu)造分為線性甘露聚糖（linear mannan）、葡甘露聚糖（glucomannan）、半乳甘露聚糖（galactomannan）和半乳葡萄甘露聚糖（galactoglucomannan）[10]。它們?cè)谑卟恕⑺?、豆制品、乳制品以及海鮮等食品的保鮮和防腐方面有很廣泛用途。

甘露聚糖的水解產(chǎn)物是甘露寡糖，具有良好的生理調(diào)節(jié)功能，能有效降低人體膽固醇水平，減少便秘，降低血糖等，還可以利用腸內(nèi)微生物調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境。具有增強(qiáng)有益菌抑制有害菌的生長和代謝的作用，如促進(jìn)雙歧桿菌的生長，因此是一種很好的食品添加劑。

2 β-甘露聚糖酶的來源

甘露聚糖在自然條件下水解成甘露寡糖主要是β-甘露聚糖酶的作用。β-甘露聚糖酶在大自然中的來源非常豐富，根據(jù)不同來源可分為植物來源（如刺槐、豆類及椰果等）、動(dòng)物來源（如海洋軟體動(dòng)物、蝸牛等低等動(dòng)物）以及微生物來源等，其中微生物來源方面產(chǎn)β-甘露聚糖酶的報(bào)道最為常見[11-12]。在植物中，β-甘露聚糖酶常見于軟木（如稻草）和發(fā)芽的植物種子（如咖啡、胡蘿卜、西紅柿等），果實(shí)（如番茄、椰子等）和貯藏器官（如萵苣等）。動(dòng)物來源的β-甘露聚糖酶種類比植物少，并且主要由海洋軟體動(dòng)物（例如貽貝，皺紋盤鮑等）產(chǎn)生。β-甘露聚糖酶的最大來源是微生物，如細(xì)菌中的假單胞菌（Pseudomonas），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；真菌中的青霉屬（Penicilliumsp.）和曲霉屬（Aspergillussp.）。

此外，微生物來源的β-甘露聚糖酶不僅因?yàn)槲⑸镔Y源的廣泛，低成本，便利的培養(yǎng)條件和簡單的操作提取，并且其活性高，通過在極端環(huán)境中篩選可以得到溫度耐受性好的較大選擇范圍的酶源，較動(dòng)植物來源的β-甘露聚糖酶具有更廣的適用范圍，目前在生產(chǎn)生活上得到了很大的推廣與應(yīng)用。

3 β-甘露聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)

1991年，Henrissat根據(jù)氨基酸序列同源性和疏水性氨基酸簇的分類將β-甘露聚糖酶分為糖苷水解酶家族5（GH5）和糖苷水解酶家族26（GH26）[13]。2008年ZHANGYL等[14]將其所研究酸熱脂環(huán)酸桿菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）Tc-12-31來源的胞內(nèi)β-甘露聚糖酶劃分為糖苷水解酶家族113（Glycosylhydrolasefamily113，GH113），這是β-甘露聚糖酶第一次被歸入一個(gè)新的家族，編碼320個(gè)氨基酸。2015年，一個(gè)新的糖苷水解酶家族134被鑒定，它起源于鏈霉菌、黑曲霉和米曲霉[15-17]。與過去五年報(bào)道的β-甘露聚糖相比，目前僅發(fā)現(xiàn)18～19 kDa的最小蛋白分子質(zhì)量甘露聚糖酶，一般酶的蛋白分子質(zhì)量為33～55kDa。2012年，ASPEBORGH等[18]將GH5家系劃分為51個(gè)亞家族。GH5家族的甘露聚糖酶可分為GH5_7、GH5_8、GH5_10、GH5_17和GH5_36亞家族。這五個(gè)亞家族中β-甘露聚糖酶的來源既有真核生物又有細(xì)菌，其成員序列有很大差別，相似性較低（＜20%）[19]，屬于GH26的β-甘露聚糖酶主要來源于細(xì)菌。GH5中的β-甘露聚糖大部分包含兩個(gè)模塊，獨(dú)立的催化區(qū)和非催化區(qū)。其中，非催化結(jié)構(gòu)域主要是碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（carbohydrate binding element，CBM），與纖維素具有較好的特異性結(jié)合。研究表明，β-甘露聚糖酶的模塊結(jié)構(gòu)與甘露聚糖骨架的識(shí)別及其側(cè)鏈的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)，但它們通常存在于酶的不同位置，具有CBM的β-甘露聚糖酶可顯著提高甘露聚糖與纖維素復(fù)合物等不溶性物質(zhì)的水解速率[20]。然而，也有一些酶，如GH26中的β-甘露聚糖酶，它們只具有催化結(jié)構(gòu)域。

目前，已經(jīng)鑒定出十多種β-甘露聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)，如低等動(dòng)物中的貽貝、植物中的西紅柿[21]和真菌中的里氏木霉（Trichodermareesei）。根據(jù)獲得的三維結(jié)構(gòu)，（β/α）8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)（見圖1）是GH5、GH26、GH113β-甘露聚糖酶共同具有的催化域結(jié)構(gòu)，由8個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊交替組成[22]。GH134家族β-甘露聚糖酶的三維結(jié)構(gòu)與上述三個(gè)家族不同，其結(jié)構(gòu)類似于卵清溶菌酶結(jié)構(gòu)。

圖1 （β/α）8-TIM桶狀結(jié)構(gòu)Fig.1 Barrel structure of(β/α)8-TIM

催化域結(jié)構(gòu)的分子表面具有一個(gè)裂縫狀的凹槽，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有催化活性。有8個(gè)空間位置和功能方面十分保守的位點(diǎn)，分別是Arg、His、Asn、Glu、His、Tyr、Glu、Trp，對(duì)酶催化活性的作用特別重要，β-甘露聚糖酶的活性口袋就是由它們共同構(gòu)成的[23]。兩個(gè)Glu殘基在所有β-甘露聚糖酶分子中是絕對(duì)保守的催化基團(tuán)并且在催化過程中充當(dāng)活性基團(tuán)，其分別是起酸堿催化和親核催化的作用。在活性位點(diǎn)周圍還存在與底物結(jié)合的其他保守氨基酸。

4 β-甘露聚糖酶的催化機(jī)制

β-甘露聚糖酶是內(nèi)切糖苷水解酶，其水解甘露糖骨架的β-1,4-D-甘露糖苷鍵。作用方式和在底物水解中獲得的產(chǎn)物通常隨酶和底物的來源而變化。例如，底物中葡萄糖和α-半乳糖的位置和含量以及酯?；潭葘⒂绊懰饽Ｊ胶退獬潭?。結(jié)晶、不溶的甘露聚糖不易降解，說明底物自身的物理狀態(tài)對(duì)此作用也會(huì)有影響。另外，不同的β-甘露聚糖酶對(duì)待水解的底物具有不同的要求。例如，源自瓜爾豆膠種子的β-甘露聚糖酶在底物中需要最少量的連續(xù)甘露糖殘基為5個(gè)，酶的結(jié)合位點(diǎn)主要在甘露聚糖主鏈的甘露糖基上的第六位自由羥基而來源于黑曲霉的則要求底物中連續(xù)殘基的個(gè)數(shù)最少為4[24]。甘露聚糖主要是雜多糖，它們的降解產(chǎn)物隨著糖鏈和結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性而變化。通過β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖后，分析該產(chǎn)物主要是聚合度為2～10的寡糖，產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生單糖，酶和底物的來源對(duì)產(chǎn)物的聚合度有影響。研究表明，一些β-甘露聚糖酶也可以進(jìn)行轉(zhuǎn)糖苷基反應(yīng)，這可能是β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖獲得的大多數(shù)產(chǎn)品是低聚糖，沒有單糖或少量單糖的原因。如GUBITZ G M等[25]以Sclerotium rolfsii來源的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖，產(chǎn)物中主要包括二糖和三糖等低聚糖，當(dāng)β-甘露聚糖酶作用于甘露糖四糖和甘露糖單糖（C14標(biāo)記）時(shí)，發(fā)現(xiàn)甘露糖單糖與甘露寡糖結(jié)合；如果底物是甘露糖四糖和半乳糖單糖（C14標(biāo)記），則產(chǎn)物主要是α-1,6-D半乳糖-β-甘露糖三糖。

β-甘露聚糖酶的催化機(jī)理與其他糖苷水解酶相似，基本上屬于雙取代反應(yīng)機(jī)理[26]。這兩個(gè)谷氨酸殘基在催化反應(yīng)中起重要作用，它們分別是酸堿催化基團(tuán)和親核催化基團(tuán)。谷氨酸的α-羧基作為親核催化基團(tuán)，攻擊底物中的異構(gòu)碳原子以形成共價(jià)中間體以裂解糖苷鍵；另一個(gè)谷氨酸作為酸堿催化基團(tuán)，首先α-羧基提供酸催化以提供質(zhì)子穩(wěn)定化，然后共價(jià)中間體提供堿催化，使水分子去質(zhì)子化，最終完成水解過程，具體過程見圖2[27-28]。

圖2 β-糖苷水解酶雙取代催化機(jī)制Fig.2 Disubstituted catalytic mechanism of β-glycoside hydrolase

GH134家族的β-甘露聚糖酶遵循立體翻轉(zhuǎn)機(jī)制（www.cazypedia.org）[27]。質(zhì)子化的Glu45作為廣義酸起作用，為過渡態(tài)底物提供質(zhì)子，使Asp57去質(zhì)子化，作為產(chǎn)生去質(zhì)子化的通用堿基，去質(zhì)子化的水充當(dāng)親核攻擊底物。與雙取代機(jī)制相比，立體轉(zhuǎn)換機(jī)制一步完成水解過程并改變異構(gòu)體的構(gòu)型，具體催化機(jī)制見圖3[28-30]。

圖3 β-糖苷水解酶翻轉(zhuǎn)催化機(jī)制Fig.3 Inverting catalytic mechanism of β-glycoside hydrolase

5 β-甘露聚糖酶的應(yīng)用

由于β-甘露聚糖酶對(duì)底物種類的作用特別廣泛，所以β-甘露聚糖酶用途廣泛。

在生物技術(shù)方面，在自然界許多多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而β-甘露聚糖酶可以作用于β-甘露聚糖的糖苷鍵，然后根據(jù)酶解產(chǎn)物中物質(zhì)的種類和比例進(jìn)行測定，再反向推斷多糖的部分或全部結(jié)構(gòu)。因此可以作為分析天然多糖的工具酶。

在造紙工業(yè)中，與β-木聚糖酶等半纖維素降解酶組合，可以從紙漿中除去半纖維素并改善紙張質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)β-甘露聚糖酶和木聚糖酶在紙漿漂白時(shí)有協(xié)同作用，同時(shí)使用可使漂白效果大幅提升同時(shí)減少了因?yàn)閴A的使用而造成對(duì)環(huán)境的污染，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境[31]。

在環(huán)境治理方面，減少環(huán)境中的β-甘露聚糖物質(zhì)可以降低消化道內(nèi)容物的粘度，減少糞便排泄，減少環(huán)境污染[20，31]，還可以吸附霉菌毒素，減少抗生素和其他化學(xué)藥物的使用。

在紡織行業(yè)，苧麻作為紡織原料由來已久，但其中的膠質(zhì)必須去掉，而傳統(tǒng)的脫膠需要高溫、高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等條件，這不僅使得纖維遭到損壞，也對(duì)環(huán)境造成了極大的污染。而β-甘露聚糖酶對(duì)于脫膠具有特異性，使得苧麻脫膠徹底、對(duì)纖維素?fù)p壞小、提高了纖維品質(zhì)。另外，β-甘露聚糖酶可有效去除附著在紡織品上的多余染料，這樣氯和堿的用量就會(huì)減少，保護(hù)了生態(tài)環(huán)境；此外，在紡織品的加工過程中，β-甘露聚糖酶還可以對(duì)布料進(jìn)行軟化、打磨、拋光，進(jìn)一步提高紡織品質(zhì)。

在飼料工業(yè)中，谷物及其副產(chǎn)品中普遍存在著一種抗?fàn)I養(yǎng)因子β-D-甘露聚糖，其在單胃動(dòng)物的消化道內(nèi)形成凝膠狀，使其消化道內(nèi)容物具有較強(qiáng)的黏性，且由于家禽和豬等單胃動(dòng)物，體內(nèi)不能產(chǎn)生甘露聚糖酶和木聚糖酶等，而很多用作飼料的植物組織含有木聚糖和甘露聚糖等半纖維素，這使得動(dòng)物飼料造成了極大的浪費(fèi)。而甘露聚糖酶起到消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，促進(jìn)畜禽生長，減少養(yǎng)殖污染[32-33]；另一方面，β-甘露聚糖酶水解產(chǎn)生的甘露寡糖可以起到益生元的作用，調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，抑制有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的生長。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，甘露聚糖類物質(zhì)作為半纖維素的第二大組分，廣泛分布于自然界中，它是所有豆科植物細(xì)胞壁的主要組成成分。消除富含葡萄糖的β-甘露聚糖對(duì)豆類的干擾，提高豆粕的能量轉(zhuǎn)化率[34-35]。

在制藥行業(yè)，甘露低聚糖是一種水溶性的膳食纖維，能夠降低血清中膽固醇和甘油三酯的含量。甘露低聚糖是雙歧桿菌的增殖因子，能夠調(diào)節(jié)腸道消化系統(tǒng)功能，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，故甘露低聚糖具有保護(hù)肝臟、提高免疫力、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、降低膽固醇等生理功能；此外，β-甘露聚糖酶水解富含有甘露聚糖植物膠而成的甘露糖可用于治療尿路感染。

在食品行業(yè)，β-甘露聚糖酶具有降解植物膠生成甘露低聚糖，作為益生元可有效降低人體膽固醇和血糖水平，增強(qiáng)人體免疫力和促進(jìn)人體腸道益生菌的生長。還可以降解咖啡豆中的甘露聚糖，避免凍干過程中凝膠的形成，以利于甘露聚糖的充分利用，提高咖啡質(zhì)量。同時(shí)，β-甘露聚糖酶在椰油的提取、增稠劑降解及果汁澄清等加工過程中也有重要作用。此外，甘露糖也有甜味可以替代蔗糖作為食品甜味劑。

除此之外，β-甘露聚糖酶在洗滌肥皂業(yè)、油氣開采業(yè)、及生物質(zhì)燃料等行業(yè)也有重要作用。

6 展望

微生物β-甘露聚糖酶的研究近年來取得了很大進(jìn)展，已經(jīng)可以進(jìn)行工業(yè)化量產(chǎn)。但能夠集大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，活性高的的高品質(zhì)β-甘露聚糖酶仍是當(dāng)前之急需?；诖?，不斷提高微生物酶生產(chǎn)水平，研究β-甘露聚糖酶的分子結(jié)構(gòu)及合成的調(diào)控機(jī)制，克隆和酶基因的高效表達(dá)，新型甘露聚糖酶的開發(fā)，促進(jìn)工業(yè)應(yīng)用是未來努力的主要方向。