過氧化物酶體增殖物受體γ對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響及機制

王兆君,張寶和

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院干部保健科,北京 100048)

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·論 著·

過氧化物酶體增殖物受體γ對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響及機制

王兆君,張寶和△

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院干部保健科,北京 100048)

目的 分析過氧化酶體增殖物受體γ(PPARγ)在高糖介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(ROS)生成中的影響與機制。方法 采用33.0 mmol/L D-葡萄糖(高糖)進(jìn)行介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為高糖介導(dǎo)組，采用二甲基亞砜處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為對照組。分別采用3種PPARγ激動劑吡格列酮、GW9662、京尼平作用于高糖介導(dǎo)組。采用一氧化氮與超氧陰離子熒光探針判定3種藥物對血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮與ROS的影響，采用蛋白免疫印跡法評估解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)水平。結(jié)果 高糖介導(dǎo)組ROS與一氧化氮表達(dá)水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3種藥物中，吡格列酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS、一氧化氮與解耦聯(lián)蛋白2的作用最強(P<0.05)。結(jié)論 PPARγ能夠明顯緩解高糖介導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成，主要通過上調(diào)解耦聯(lián)蛋白2發(fā)揮作用。

血管內(nèi)皮細(xì)胞； 活性氧； 過氧化物酶體增殖物受體γ； 高糖介導(dǎo)

糖尿病是影響人類健康的常見疾病，也是誘發(fā)心腦血管病變的主要風(fēng)險因素，長期血糖異常極易發(fā)生心力衰竭、腦卒中、腦梗死等并發(fā)癥，致患者生命健康受到更嚴(yán)重的影響[1]。血管內(nèi)皮損傷是心血管疾病發(fā)生的早期特征，高糖狀態(tài)所形成的糖基化終末產(chǎn)物、線粒體功能障礙等情況均會嚴(yán)重?fù)p傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，而氧化應(yīng)激是多種潛在風(fēng)險損害過程的共同環(huán)節(jié)[2]。既往報道多認(rèn)為，過氧化酶體增殖物受體γ(PPARγ)能夠發(fā)揮良好的代謝保護(hù)作用，也可通過抗氧化應(yīng)激緩解心腦血管功能障礙，但PPAPγ對血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧(ROS)的影響情況及主要機制尚缺乏準(zhǔn)確定論[3]。本研究通過建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，分析PPAPγ在高糖介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS中的影響情況，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 采用上海漢博生物科技有限公司提供的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株。儀器：三洋二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Bio-Rad電泳儀與凝膠成像系統(tǒng)，瑞士Kinematica勻漿機，美國Millipore去離子水過濾器，上海光學(xué)儀器廠熒光顯微鏡，美國Beckman pH劑與核酸蛋白分析儀。材料：Gibco 胎牛血清、Sigma 4,5-二氨基乙酰乙酸熒光素、二氫乙啶、抗菌藥物、上海通派生物科技有限公司提供的抗GAPDH抗體與抗解耦聯(lián)蛋白2抗體、GIBCO DMEM培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用低糖DMEM培養(yǎng)基裝置人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株，加入1%抗菌藥物與10%胎牛血清，混合均勻后置于5%CO2與37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)。采用同體積二甲基亞砜處理后為對照組；采用33.0 mmol/L D-葡萄糖培養(yǎng)后作為高糖介導(dǎo)組。分別在高糖介導(dǎo)培養(yǎng)中滴入10 μmol/L吡格列酮、5 μmol/L GW9662與10 μmol/L吡格列酮、10 μmol/L京尼平與10 μmol/L吡格列酮，培養(yǎng)時間為1 d。采用6孔板裝置培養(yǎng)細(xì)胞，各組培養(yǎng)均反復(fù)開展3次以上。

1.2.2 DHE染色 采用DHE燃料與二甲基亞砜配置0.01 mol/L儲備液，并給予低溫避光儲存。將40 nmol/L的染色液加入至處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)30 min。采用NaCl、KCL、NaHCO3、MgSO4、KH2PO4、CaCl2與pH劑制成Krebs溶液，再對熒光顯微鏡開展3次沖洗。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮檢測 采用5 mmol/L的DAF-2DA加入至處理的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，置于37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)45 min，再應(yīng)用Krebs溶液沖洗的熒光顯微鏡觀察，選擇FITC濾光片完成照相。

1.2.4 蛋白免疫印跡檢測 提取100 mg細(xì)胞，并將裂解液加入至細(xì)胞中，有效提取蛋白并進(jìn)行濃度檢測。獲取50 μg蛋白上樣通過聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，封閉并將Ⅰ抗與Ⅱ抗加入，給予化學(xué)發(fā)光試劑處理再行X線片曝光，最后采用凝膠成像系統(tǒng)完成分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組ROS熒光強度、一氧化氮熒光強度、解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)結(jié)果 見表1。高糖介導(dǎo)下ROS與一氧化氮表達(dá)與同體積二甲基亞砜處理后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，高糖介導(dǎo)+吡格列酮處理后ROS、一氧化氮熒光強度與解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)同高糖介導(dǎo)組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但應(yīng)用GW9662后ROS、一氧化氮熒光強度及解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)與吡格列酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而應(yīng)用京尼平后，ROS與一氧化氮熒光強度同吡格列酮組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 PPARγ對高糖介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS、一氧化氮與解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與高糖介導(dǎo)組比較，bP<0.05；與高糖介導(dǎo)+吡格列酮組比較，cP<0.05。-表示無數(shù)據(jù)。

2.2 各組圖像表現(xiàn) 見圖1。

注：①為高糖介導(dǎo)；②為高糖介導(dǎo)+吡格列酮；③為高糖介導(dǎo)+吡格列酮+GW9662；④為高糖介導(dǎo)+吡格列酮+京尼平；⑤為對照組。

圖1 各組圖像表現(xiàn)

3 討 論

高糖介導(dǎo)氧化應(yīng)激水平升高是糖尿病患者發(fā)生心腦血管疾病的主要誘發(fā)因素，血管內(nèi)皮細(xì)胞則為ROS的首要損傷區(qū)域[4]。伴隨臨床藥物不斷推陳出新，眾多研究均證實PPARγ可有效抑制人體代謝變化，對動、靜脈血管發(fā)揮良好的保護(hù)作用[5-6]。吡格列酮是臨床經(jīng)常用的PPARγ激動劑，可顯著抑制患者血糖水平，但其血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用仍缺乏證實[7]。為進(jìn)一步明確PPARγ激動劑吡格列酮對高糖介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的影響，本研究通過建立損傷細(xì)胞模型，經(jīng)不同方式培養(yǎng)觀察明確其藥理機制。本研究結(jié)果顯示，高糖介導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS表達(dá)明顯上升，而ROS生成抑制作用促使血管內(nèi)皮保護(hù)物一氧化氮水平降低，進(jìn)而會嚴(yán)重加劇血管內(nèi)皮的損害程度。吡格列酮應(yīng)用后高糖介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激受到顯著拮抗作用，其ROS熒光強度顯著低于未應(yīng)用吡格列酮細(xì)胞，而相應(yīng)一氧化氮熒光強度提高，提示吡格列酮可預(yù)防高糖緩解中一氧化氮水平降低情況，從而發(fā)揮血管內(nèi)皮保護(hù)的作用。

為進(jìn)一步明確PPARγ對高糖介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生影響的主要機制，本研究還進(jìn)一步開展解耦聯(lián)蛋白免疫印跡檢驗。國外研究顯示，PPARγ對解耦聯(lián)蛋白2 RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)具有上調(diào)作用，而解耦聯(lián)蛋白2是線粒體內(nèi)膜中的主要組成蛋白，其介導(dǎo)質(zhì)子漏對ROS生成具有阻滯作用[8-9]。解耦聯(lián)蛋白在氧化應(yīng)激作用下會迅速提高，其表達(dá)提升后可增加抗氧化作用，積極保護(hù)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，通過調(diào)節(jié)其表達(dá)水平進(jìn)而加強糖尿病血管內(nèi)皮損傷的預(yù)防性作用[10]。本研究采用蛋白免疫印跡法檢測PPARγ對解耦聯(lián)蛋白的影響，結(jié)果證實吡格列酮能夠提高高糖環(huán)境中的蛋白表達(dá)水平，吡格列酮應(yīng)用前、后解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，由此證實藥物對ROS的主要影響機制為解耦聯(lián)蛋白2表達(dá)的變化。

綜上所述，PPARγ能夠明顯緩解高糖介導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成，主要通過上調(diào)解耦聯(lián)蛋白2發(fā)揮其藥物效果，可為糖尿病患者的心血管疾病預(yù)防提供良好作用。

[1]潘艷麗,郭長策,章秋.呲格列酮對高糖誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2014,35(9):48-51.

[2]張楠,丁俊,章秋,等.呲格列酮對血管內(nèi)皮細(xì)胞及JNK信號通路的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2011,46(2):150-153.

[3]王宏,葉丹.二甲雙胍聯(lián)合呲格列酮對2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能機胰島素抵抗的影響[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生,2013,51(20):25-27.

[4]陳培紅.呲格列酮對2型糖尿病患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能機胰島素抵抗的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2012,16(23):109-111.

[5]黃丹丹,雷閩湘,陳本美,等.呲格列酮對高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及作用機制[J].中國糖尿病雜志,2009,18(9):709-710.

[6]盧輝和,黎葉飛,盛臻強,等.吡格列酮抗炎作用對代謝綜合征患者胰島素敏感性、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響[J].實用臨床醫(yī)藥雜志,2012,16(19):38-39.

[7]盛臻強,黎葉飛,盧輝和.吡格列酮的抗氧化作用對代謝綜合征患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響[J].南通大學(xué)學(xué)報,2012,32(3):191-193.

[8]Bugge A,Siersbaek M,Madsen MS,et al.A novel intronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma enhancer in the uncoupling protein (UCP) 3 gene as a regulator of both UCP2 and 3 expression in adipocytes[J].J Biol Chem,2010,285(23):17310-17317.

[9]Ma S,Ma L,Yang D,et al.Uncoupling protein 2 ablation exacerbates high-salt intake-induced vascular dysfunction[J].Am J Hypertens,2010,23(8):822-828.

[10]Sasaki S,Inoguchi T.The role of oxidative stress in the pathogenesis of diabetic vascular comlications[J].Diabetes Metab J,2012,36(4):255-261.

Effect and mechanism of PPARγ on the generation of ROS in vascular endothelial cells

WANGZhao-jun,ZHANGBao-he△

(DepartmentofCadreHealth,NavyGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of PPARγ on the generation of reactive oxygen species (ROS) in vascular endothelial cells induced by high concentration glucose.Methods Human umbilical vein endothelial cells cultured with 33.0 mmol/L D-glucose (high concentration glucose) were set as high concentration glucose induced group,which treated by DMSO were set as control group.High concentration glucose induced group was treated by 3 kinds of PPAPγ agonists,including pioglitazone,GW9662 and genipin.Effects of 3 kinds of drugs on NO and ROS in vascular endothelial cells were assessed by using the fluorescent probes of NO and superoxide anion.The expression level of uncoupling protein 2 was determined by Western blot.Results There were significant differences of the levels of NO and ROS between high concentration glucose induced group and control group induced by DMSO (P<0.05).Among 3 kinds of drugs,pioglitazone had the strongest effects on the levels of ROS,NO and uncoupling protein 2 (P<0.05).Conclusion PPARγ can significantly alleviate the generation of ROS in vascular endothelial cells induced by high concentration glucose,which plays a role mainly through the up-regulation of uncoupling protein 2.

vascular endothelial cell； reactive oxygen species； PPARγ； high concentration glucose induced

王兆君，女，碩士,主治醫(yī)師，主要從事老年人群的冠心病和糖尿病方面的研究?！?/p>

,E-mail：Zbh129778@sina.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.24.012

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1672-9455(2015)24-3643-02

2015-05-05

2015-07-15)