生物被膜的抗菌藥物耐藥機(jī)制及研究進(jìn)展

張 健 綜述,林一民 審校

(重慶市腫瘤研究所臨床檢驗(yàn)科 400030)

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生物被膜的抗菌藥物耐藥機(jī)制及研究進(jìn)展

張 健 綜述,林一民△審校

(重慶市腫瘤研究所臨床檢驗(yàn)科 400030)

生物被膜； 感染； 耐藥機(jī)制

細(xì)菌生物被膜(BBF)常形成于導(dǎo)尿管、靜脈插管、腹膜透析插管、整形外科裝置、假肢、人工心臟瓣膜等植入性醫(yī)用器械表面和牙齒、壞死骨片、囊性纖維化的肺葉等場(chǎng)所。因?yàn)锽BF其細(xì)菌對(duì)抗菌藥物及其他化學(xué)殺菌劑有比離散的細(xì)菌更強(qiáng)大的抵抗能力,故BBF的形成被認(rèn)為是醫(yī)院院內(nèi)感染的重要原因[1]。臨床上對(duì)BBF形成的本質(zhì)原因及耐藥機(jī)制現(xiàn)還處在研究之中,越來越多的新技術(shù)，如分子生物學(xué)技術(shù)、電鏡掃描技術(shù)、激光顯微鏡及流式細(xì)胞技術(shù)的廣泛應(yīng)用,這些新技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用使BBF的研究技術(shù)逐漸深入并變得更加成熟，對(duì)怎樣阻止BBF的形成及找到更合理應(yīng)用的抗菌藥物是醫(yī)學(xué)面臨的重要課題。今對(duì)目前BBF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和對(duì)抗菌藥物耐藥機(jī)制的形成特征及機(jī)制研究綜述如下，為相關(guān)研究提供參考。

1 BBF的概念及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

1.1 BBF的概念 BBF又稱為菌膜,是一些微小細(xì)菌為了適應(yīng)外在生成環(huán)境,形成于其固體表面并不可逆地黏附于固相物質(zhì)表面形成的一種特殊存在方式[2]。是細(xì)菌之間相互協(xié)調(diào)極其復(fù)雜的構(gòu)成形式，是微菌落聚集物，蛋白質(zhì)及多糖組成的復(fù)合物是其主要構(gòu)成，是多細(xì)菌組成的膜狀結(jié)構(gòu)，廣泛存在自然環(huán)境中，無論哪種細(xì)菌在成熟條件下都可形成BBF。細(xì)菌在一些惰性物質(zhì)表面吸附，如輔助的醫(yī)學(xué)材料，當(dāng)細(xì)菌在表面黏附后,被細(xì)胞分泌的基質(zhì)成分包被,其細(xì)胞分泌的物質(zhì)，如糖、蛋白、脂肪等多糖成分組成的復(fù)合物逐漸將細(xì)菌粘連起來，并形成膜狀物質(zhì)。

1.2 BBF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) BBF是細(xì)菌在自然環(huán)境中出于本能而采取的一種存在方式，是一種功能特異生物群落，表多糖分子聚合物支持、保護(hù)BBF表面，內(nèi)含水成分高達(dá)97%。有研究表明，BBF存在于各種主要的生物大分子，如糖、蛋白質(zhì)、脂肪、DNA及RNA等。其突出的是具有特性的細(xì)胞功能，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)廢物的運(yùn)輸，可使遺傳上一致的細(xì)菌個(gè)體表現(xiàn)不同的特征。其復(fù)雜的空間構(gòu)成，如起伏的群山一樣隆起的單體形成，單個(gè)獨(dú)立構(gòu)成單位被劃分為3個(gè)部分，包括體、底和尾[3]。主要構(gòu)建成分是由密度極高的表多糖組成，水氧分子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從最底層的管路通道進(jìn)入BBF，細(xì)菌就位于其空間結(jié)構(gòu)內(nèi)部[4]。高密度表多糖分子起到了骨架和表面保護(hù)層的作用，能有效抵抗外界物質(zhì)的壓力，幫助細(xì)菌群落進(jìn)一步整合，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧集中的區(qū)域，有較多細(xì)菌存在[5-6]。除了表多糖，BBF中還存在有極大數(shù)量的人血清中蛋白質(zhì)和細(xì)菌的代謝產(chǎn)物等，當(dāng)遇上較強(qiáng)的外部壓力干擾，BBF形同蝌蚪樣的尾部形狀，這時(shí)從該處就會(huì)釋放出細(xì)菌，逐漸進(jìn)入血液循環(huán)散布開來，導(dǎo)致菌血癥[3]。

2 BBF的形成和臨床鑒定方法

2.1 BBF的形成 BBF的形成全過程是一系列包括物理、生物及化學(xué)演變的進(jìn)程過程，各個(gè)階段的形成因素與外界環(huán)境及力學(xué)流體等條件是緊密相連的。

2.1.1 細(xì)菌的黏附 細(xì)菌黏附是其獨(dú)特的黏附素蛋白能夠識(shí)別宿主的受體，它具有很強(qiáng)的特異性、選擇性。這種過程循環(huán)往復(fù)持續(xù)進(jìn)行，呈動(dòng)態(tài)變化。由蛋白質(zhì)及糖類形成的膜狀結(jié)構(gòu)形成于生物材料上，這里有很多蛋白定植于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌細(xì)胞受體所結(jié)合形成配體，當(dāng)表面化學(xué)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，一些高分子材料就立即吸附在其表面[7];隨后，經(jīng)過特異受體所結(jié)合的配體黏附機(jī)制，細(xì)菌的細(xì)胞就在這些培養(yǎng)基表面進(jìn)行黏附。

2.1.2 BBF的發(fā)展 細(xì)菌黏附后不久，調(diào)節(jié)其基因，分泌大量胞外多糖，通過正向調(diào)節(jié)，貼壁細(xì)胞的活動(dòng)，在密度感應(yīng)系統(tǒng)里，通過特定細(xì)胞的信號(hào)傳感作用，這些細(xì)胞分子與其他可感應(yīng)的周圍細(xì)菌或細(xì)菌群落相結(jié)合[8]。這種正向調(diào)節(jié)的反應(yīng)是由有毒力的因子引起，也包括細(xì)胞外一些聚合形成的物質(zhì)進(jìn)行分泌調(diào)節(jié)作用[9-10]。細(xì)胞外多糖分子的存在對(duì)BBF的構(gòu)成起非常關(guān)鍵的作用，此時(shí)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物及紫外線的抵抗力增強(qiáng)。

2.1.3 BBF的成熟 BBF通過消耗可溶性養(yǎng)分，吸收其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而成熟，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源包括一些細(xì)菌或哺乳動(dòng)物的血小板等細(xì)胞，成熟BBF上的細(xì)菌可從黏附的血小板上脫落下來，這些脫落下來的細(xì)菌可分泌形成薄膜的糖蛋白類物質(zhì)[11-13]。對(duì)不同環(huán)境和不同的菌種，在細(xì)菌進(jìn)行增殖時(shí)，可逐步形成松緊不一和厚薄程度不一致的BBF構(gòu)建體系。

2.2 BBF的鑒定 因?yàn)槲⑿〖?xì)菌菌落逐漸形成的BBF用肉眼不易直接觀察，需要經(jīng)過特殊的染色及放大過程處理才可以對(duì)BBF進(jìn)行鑒定。從國(guó)內(nèi)外的研究可以看出，銀染法成為目前最常用的染色方法。銀染法是將待測(cè)標(biāo)本用硝酸銀溶液經(jīng)過浸泡處理,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察和鑒定已經(jīng)著色的BBF的一種方法，它是一種快速染色法，能夠證明多糖蛋白類物質(zhì)和BBF的存在[14]。相比電子顯微鏡和其他激光顯微鏡的鑒定方法更實(shí)用、方便、價(jià)廉，已經(jīng)得到廣泛的臨床應(yīng)用[15]。

2.3 BBF的調(diào)控 BBF的形成過程受多種因素控制，BBF中的細(xì)胞相連密切，胞外信號(hào)濃度逐漸增高，使基因得到進(jìn)一步調(diào)控，使BBF中形成了不同的多細(xì)胞克隆，并構(gòu)成了具有結(jié)構(gòu)性獨(dú)特的群體集合。其中革蘭陰性菌和陽性菌落群體感應(yīng)系統(tǒng)的信號(hào)分子不同，這些有利于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力，是細(xì)菌基因調(diào)節(jié)的組成部分。

3 BBF的感染特征和耐藥機(jī)制

對(duì)疫苗及抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，加上各級(jí)干預(yù)措施的進(jìn)行,由單一細(xì)菌引起的絕大多數(shù)具有感染性的疾病已能夠快速得到控制(除外多重耐藥細(xì)菌),現(xiàn)今人類由條件致病菌所致的感染日漸增多,特別是在抵抗力低下的情況下加上各種插入性醫(yī)用器械裝置的不斷應(yīng)用。使各種感染頻繁出現(xiàn)并常與BBF的形成相關(guān)。病原微生物，如球菌、桿菌和念珠菌等最為常見。一旦形成BBF,就對(duì)抗菌藥物的抵抗力增強(qiáng),使用常用抗菌藥物將很難徹底消滅，只能殺滅BBF表面或血液中引起感染產(chǎn)生的游離病原細(xì)菌。在環(huán)境改變和人體自身抵抗力降低時(shí)，BBF中還活著的細(xì)菌趁機(jī)得到釋放，引起新一輪感染發(fā)生。

3.1 BBF引起感染的特征 (1) 相對(duì)靜止和發(fā)作階段的相互轉(zhuǎn)化過程，使病情反復(fù)，轉(zhuǎn)為慢性;(2) 由于耐藥出現(xiàn)，抗菌藥物剛開始用時(shí)治療效果顯著,隨后其療效明顯下降;(3)導(dǎo)致疾病的微生物主要來自皮膚表面和所處環(huán)境,主要病原微生物包括葡萄球菌、腸道菌、假單胞菌屬等[16]。

3.2 BBF的耐藥機(jī)制

3.2.1 BBF的滲透屏障保護(hù)作用 BBF是阻止抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部的天然屏障。其細(xì)胞外的糖蛋白分子形成屏障作用，能夠很好地阻礙酶、補(bǔ)體等大分子和抗菌藥物肽類等小分子物質(zhì)的侵入[17]。滲透作用不僅可以降低BBF內(nèi)抗菌藥物的濃度,也能幫助內(nèi)酰胺酶使抗菌藥物作用失去活性。這種屏障作用和酶的降解效應(yīng)共同發(fā)揮效應(yīng),使BBF耐藥性得到增強(qiáng)。不同的BBF對(duì)藥物的滲透阻止作用不盡相同，如銅綠假單胞菌形成的BBF對(duì)環(huán)丙沙星類藥物和對(duì)過氧化氫有屏障阻止作用，某些藥物能透過肺炎克雷伯菌形成BBF，如氨芐西林和環(huán)丙沙星。細(xì)胞外的多糖分子帶有正電離子，氨基糖苷類抗菌藥物也帶有正電離子，這種同種電荷效應(yīng)加強(qiáng)了電荷屏障作用的強(qiáng)度，使抗菌藥物的滲透作用難以進(jìn)行。

3.2.2 BBF內(nèi)環(huán)境的影響 BBF突出特點(diǎn)是呈階梯梯度增加的營(yíng)養(yǎng)物濃度,此種特征同藥物的抗藥性能力緊密相關(guān)。有研究表明,BBF 內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏或供應(yīng)受限是細(xì)菌耐藥產(chǎn)生的重要因素之一[18]。由于細(xì)菌膜內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏,致細(xì)菌緩慢生長(zhǎng);氧氣在BBF內(nèi)很快被耗盡,使被膜內(nèi)部形成厭氧環(huán)境,氨基糖苷類抗菌藥物,如氨基糖苷類藥物在厭氧情況下對(duì)細(xì)菌的抗菌作用不如有氧環(huán)境強(qiáng);在局部積聚的細(xì)菌酸性代謝產(chǎn)物可致膜內(nèi)外pH值形成顯著差異;致細(xì)菌滲透壓的變化，由于抗菌藥物對(duì)生長(zhǎng)停滯細(xì)菌作用不顯著，一旦停用抗菌藥物，細(xì)菌繁殖力增強(qiáng)，造成感染復(fù)發(fā)，使BBF對(duì)抗菌藥物的滲透能力降低,綜合作用使BBF的生長(zhǎng)情況受阻,進(jìn)而產(chǎn)生耐藥[19-20]。

3.2.3 BBF表達(dá)的基因 已經(jīng)知道許多與BBF耐藥性相關(guān)的基因,如hipA B、mar、vlzcS、relA及sulA等基因。銅綠假單胞菌被Drenkard發(fā)現(xiàn)有一種能調(diào)節(jié)細(xì)菌變異的蛋白質(zhì)(PvrR),PvrR能調(diào)控銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的敏感度,其對(duì)應(yīng)基因PvrR在有生物膜的細(xì)菌里轉(zhuǎn)錄積極，它能抑制或激活PvrR對(duì)銅綠假單胞菌形成的BBF耐藥[21]。Whiteley等學(xué)者也發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌的BBF中tolA基因有高表達(dá)效果，脂多糖的構(gòu)造受tolA基因產(chǎn)物的影響,降低了氨基糖苷類抗菌藥物結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞外膜的能力。進(jìn)一步研究表明，這些調(diào)控基因的研究,有助于人們更深入認(rèn)識(shí)BBF的耐藥機(jī)制，對(duì)預(yù)防生物被膜引起的疾病具有很重要的臨床價(jià)值[22-23]。

3.2.4 傳感效應(yīng)的表達(dá) 細(xì)菌的傳感調(diào)控效應(yīng)(QS)是相同或不同種類細(xì)菌對(duì)細(xì)菌目前所處環(huán)境、對(duì)群體感知、信息相互交流及發(fā)生各種反應(yīng)的表現(xiàn)形式。不同種類的細(xì)菌及所用抗菌藥物的種類不同，QS在抗菌藥物耐藥性中的表現(xiàn)機(jī)制不盡相同。Davies等發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中的突變株lasR、lasIQS無法形成正常的BBF結(jié)構(gòu)。有研究結(jié)果表明，銅綠假單胞菌的突變株如QS對(duì)抗菌藥物和清潔劑無明確影響;新近報(bào)道對(duì)利福平敏感的金黃色葡萄球菌QS突變株,對(duì)苯唑西林卻不敏感，該突變株對(duì)利福平的敏感特性與之親代相比并無明顯差異[24-25]。所以，密度感應(yīng)系統(tǒng)的耐藥機(jī)制還需更深入的研究。

3.2.5 BBF的獨(dú)特表型 在與醫(yī)用輔料接觸產(chǎn)生黏附和聚集時(shí)，細(xì)菌可能被誘導(dǎo)而形成一種膜的獨(dú)特表型結(jié)構(gòu),能夠識(shí)別膜內(nèi)不同表達(dá)的基因,以阻止抗菌藥物的殺傷效果[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，在低氧氟沙星濃度下,外排泵缺失株的BBF對(duì)氧氟沙星的敏感性明顯強(qiáng)于超表達(dá)株[27]。在抗菌藥物選擇壓力作用下,細(xì)菌可改變外膜蛋白(OmpS)，特別是膜上微孔蛋白的數(shù)量和組成，降低細(xì)菌體外膜的通透性,可有效阻止抗菌藥物進(jìn)入菌體發(fā)揮作用而產(chǎn)生耐藥性。比如,腸道菌如大腸埃希菌的微孔蛋白主要有OmpF和OmpC等,與抗菌藥物通透性相關(guān)的是OmpF,假如因?yàn)楸磉_(dá)水平的變化或缺失,可降低其通透性,使抗菌藥物無法進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),進(jìn)而可致細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生。

4 BBF的防治和控制

4.1 生物被膜前控制 在BBF生成前需要選取足量和敏感的抗菌藥物,為了不因疾病進(jìn)入慢性而形成BBF;在用醫(yī)用材料上選用低表面能和黏附力低的用品，最好不將這些醫(yī)療器械留于機(jī)體內(nèi)而形成BBF。

4.2 生物被膜形成過程中控制 BBF的形成中浮游菌的調(diào)控→阻斷定植過程，從而抑制BBF黏附。可誘導(dǎo)BBF附著在它所需要的鞭毛、菌毛等連接性結(jié)構(gòu)上，能致其細(xì)胞突變而不能與BBF黏附聚集?？辜?xì)菌黏附和聚集生物材料的使用，可抑制細(xì)菌菌落形成，防止細(xì)菌黏附。對(duì)臨床常用的醫(yī)用導(dǎo)管器材不斷改進(jìn)能夠極好地防止細(xì)菌黏附、復(fù)制和定植。亞抑菌藥物濃度的抗菌藥物可抑制最初時(shí)段黏附于醫(yī)用器材上的細(xì)菌及形成BBF。降解BBF的細(xì)胞外基質(zhì)或通過噬菌體來達(dá)到抑制BBF形成。

4.3 阻斷BBF的屏障 比如多黏菌素這樣的抗菌藥物能夠通過破壞BBF的完整性及增大被膜的通透性能來實(shí)現(xiàn)抗菌效果。本研究已經(jīng)知曉很多種可增強(qiáng)膜通透性的物質(zhì)，這些包括常用的抗菌藥物，如大環(huán)內(nèi)酯類和氨基糖苷類等抗菌藥物。

4.4 其他控制BBF的方案 對(duì)抗菌藥物的聯(lián)合使用，如聯(lián)合使用小劑量的大環(huán)內(nèi)酯類藥物與對(duì)BBF通透性較強(qiáng)的藥物，如氟喹諾酮類能治療與BBF相關(guān)的感染性疾病,現(xiàn)已取得了明顯效果。有研究表明,氟喹諾酮類加大環(huán)內(nèi)酯類/磷霉素是目前最有效的治療生物被膜菌感染的方案[28]。

5 展 望

BBF的研究使微生物學(xué)發(fā)展邁出了重要一步，隨著抗菌藥物的廣泛使用，細(xì)菌的耐藥問題日益嚴(yán)重，如何合理利用抗菌藥物、研究BBF耐藥機(jī)制，控制細(xì)菌耐藥在臨床治療具有重要意義。BBF的臨床研究目前尚處在起步階段，還有很多方面的最基本問題尚需解決。比如BBF內(nèi)細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥機(jī)制至今都無一個(gè)正確清晰的依據(jù)，BBF的形成原因及形成過程、菌落群體如何分工其功能尚待進(jìn)一步研究。伴隨著醫(yī)學(xué)生物技術(shù)的不斷進(jìn)步和開發(fā)利用，對(duì)BBF的認(rèn)識(shí)及控制必將進(jìn)一步深入，最終必然會(huì)找到徹底征服生物被膜相關(guān)感染的方法。人類將更好地控制細(xì)菌感染。

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△通訊作者,E-mail：2602214857@qq.com。

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