Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義研究

彭輝 肖仁斌 王江濤

[摘要]目的 探討Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌患者中的表達(dá)及臨床意義。方法 選擇2017年3月～2018年10月江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院治療的40例宮頸癌患者作為研究對(duì)象，所有患者均行手術(shù)治療，術(shù)中切除病灶組織及癌旁組織，獲得新鮮標(biāo)本。采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定獲得宮頸癌組織及癌旁組織的低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、Keap1陽(yáng)性率。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)測(cè)定Keap1-Nrf2-HIF-lα基因通路表達(dá)量。結(jié)果 宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽(yáng)性率，均高于癌旁組織（P<0.05）。免疫組化下Nrf2主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞核內(nèi)，部分位于胞質(zhì)內(nèi)，而HIF-1α、Keap1在宮頸癌組織中多表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)。宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量，高于癌旁組織（P<0.05）。結(jié)論 Keap1/Nrf2/HIF-1a通路在宮頸癌中呈表達(dá)，可能參與了宮頸癌疾病發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程。

[關(guān)鍵詞]Keap1/Nrf2/HIF-1α通路;宮頸癌;免疫組織化學(xué)法;RT-PCR技術(shù)

[中圖分類號(hào)] R277.733.4? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）3（c）-0004-04

[Abstract] Objective To explore the expression and clinical significance of Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway in cervical cancer. Methods A total of 40 patients with cervical cancer treated in our hospital from March 2017 to October 2018 were selected as subjects in this study. All the patients were treated by surgery. The lesion tissue and adjacent tissues were removed during the operation， and fresh specimens were obtained. The positive rates of hypoxia-inducible factor-1α （HIF-1α）， NF-E2 related factor 2 （Nrf2） and Keap1 in cervical cancer tissues and adjacent tissues were determined by immunohistochemistry. The expression of Keap1/Nrf2/HIF-1α gene pathway was determined by RT-PCR. Results The positive rates of HIF-1α， Nrf2 and Keap1 in cervical cancer tissues were higher than those in adjacent tissues （P<0.05）. Under immunohistochemistry， Nrf2 was mainly expressed in the nucleus of cervical cancer cells， partially in the cytoplasm; while HIF-1α and Keap1 were mainly expressed in the cytoplasm of cervical cancer tissues. The expression of the Keap1/Nrf2/HIF-1α gene pathway was higher in cervical cancer tissues than that in the adjacent tissues （P<0.05）. Conclusion The Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway is expressed in cervical cancer and may be involved in the pathogenesis and development of cervical cancer.

[Key words] Keap1/Nrf2/HIF-1α pathway; Cervical cancer; Immunohistochemistry; RT-PCR technology

宮頸癌是臨床上常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，其病死率在所有婦女癌癥死亡率中居于第二位[1]。手術(shù)是宮頸癌患者首選治療方法，通過(guò)手術(shù)能切除病灶組織，延緩病情發(fā)展，但是由于宮頸癌發(fā)病早期臨床癥狀缺乏典型性，多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)是中、晚期，喪失手術(shù)時(shí)機(jī)[2]。化療、放療是手術(shù)的補(bǔ)充治療方法，雖然能改善患者癥狀，但是患者治療耐受性較差，會(huì)對(duì)機(jī)體免疫水平產(chǎn)生影響。臨床研究表明[3-4]：宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素過(guò)程，存在缺氧微環(huán)境，尤其是在腫瘤擴(kuò)增中，缺氧更加利于腫瘤細(xì)胞代謝、凋亡抵抗，有助于新生血管的生成、腫瘤的轉(zhuǎn)移。低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是由缺氧誘導(dǎo)的、連接在促紅細(xì)胞生成素基因缺氧反應(yīng)元件上的一個(gè)核因子;而目前抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路中以Keap1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）-NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2 related factor 2，Nrf2）誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答機(jī)制多見(jiàn)，但是在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義缺乏研究[5-6]。因此，本文采用隨機(jī)對(duì)照方法開(kāi)展研究，探討Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌患者中的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選擇2017年3月～2018年10月江西省萍鄉(xiāng)市湘雅萍礦合作醫(yī)院治療的40例宮頸癌患者作為研究對(duì)象，年齡35～76歲，平均（67.85±5.66）歲;病程1～5個(gè)月，平均（2.35±0.45）個(gè)月。病理類型：鱗癌34例，腺癌6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者符合宮頸癌臨床診斷[7]，均經(jīng)手術(shù)病理最終確診;②患者均行手術(shù)治療，均能耐受手術(shù);③患者能遵醫(yī)完成相關(guān)檢查、治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神異?；驘o(wú)法耐受手術(shù)治療者;②術(shù)前行放化療、免疫治療或其他方法治療者。選擇同期手術(shù)患者癌旁5 cm正常組織作為對(duì)照。本研究均得到我院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2儀器與試劑

抗人的HIF-1α（28b）單抗及?？故蟮亩蘒gG抗。即用型超敏免疫組化染色試劑盒及顯色試劑盒（Vector股份有限公司），兔抗人多克隆β-action（PR-0255）抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（德國(guó)羅氏診斷有限公司）;RT-PCR試劑盒和膜（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3方法

1.3.1 HIF-1α、Nrf2、Keap1陽(yáng)性率的測(cè)定? 采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定獲得宮頸癌組織及癌旁組織HIF-1α、Nrf2、Keap1表達(dá)。取手術(shù)過(guò)程中的病灶組織，向不同組織中加入蒸餾水與濃度為30.0%的H2O2，常溫下加入內(nèi)源性酶并進(jìn)行10 min滅活，PBS連續(xù)進(jìn)行3次洗滌。將最終獲得的切片放置在0.01 M枸櫞酸鹽緩沖液中，加入生理鹽水控制溶液使pH最終為6。電爐加熱直到煮沸，間隔5 min后再次進(jìn)行煮沸，常溫下冷卻，采用PBS完成2次洗滌，每次洗滌5 min，最后加入5% BSA封閉液并加入HIF-1α、Nrf2、Keap1蛋白（稀釋濃度為1：100）一抗，一滴。滴加完畢后進(jìn)行3次PBS洗滌;在1 ml底物中加入HIF-1α、Nrf2、Keap1蛋白二抗一滴，混合后常溫下顯色，蘇木素復(fù)染后封片，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞數(shù)量，每份標(biāo)本測(cè)定3次，取平均值[8-9]。

1.3.2判斷方法? 參考奧爾雷德評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別從細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)量（1～4分）、染色強(qiáng)度（0～12分）完成免疫組化染色評(píng)分，總分16分，分值越高，陽(yáng)性率越高[10-11]。

1.3.3 Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量? 采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）技術(shù)測(cè)定Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量。①設(shè)計(jì)引物，完成標(biāo)本組織RNA的提取，并對(duì)獲得的標(biāo)本完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、電泳。②Keap1/Nrf2/HIF-1α基因測(cè)定。采用PCR完成目的基因的擴(kuò)增，以β-actin基因作為對(duì)照，設(shè)定總反應(yīng)體50 μl（10×Reaction Buffer 5 μl）、dNTP（2.5 μmol/leach）的混合物2 μl、預(yù)測(cè)引物1（12.5 pmol/μl）、預(yù)測(cè)引物2（12.5 pmol/μl）、Actin引物1、Actin引物2各1 μl、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3 μl、Taq DNA Polymerase（5 U/μl）1 μl、ddH2O擴(kuò)容至50 μl）。③擴(kuò)增條件的設(shè)定。設(shè)定反應(yīng)條件：30℃，10 min;42℃，30 min;99℃，5 min;5℃，5 min，連續(xù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃下完成10 min延伸，10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μl在1.2%瓊脂糖（含EB 0.5 ng/ml）上電泳，紫外燈下觀察結(jié)果觀察結(jié)果并照相，吸光度掃描儀掃描后PCR條帶用軟件進(jìn)行定量分析，每一個(gè)基因的表達(dá)量用β-actin內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果為基因表達(dá)量HIF-lα對(duì)β-actin內(nèi)參的比值，以上結(jié)果重復(fù)3次，取平均值[12]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同組織中HIF-1α、Nrf2、Keap1陽(yáng)性率的比較及宮頸癌組織免疫組化結(jié)果

宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽(yáng)性率，均高于癌旁組織的陽(yáng)性率（P<0.05）（表1）。

2.2不同組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量情況

宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量高于癌旁組織中的表達(dá)量（P<0.05）（圖2）。

3討論

臨床文獻(xiàn)報(bào)道，宮頸癌的發(fā)生與內(nèi)源性氧化應(yīng)激反應(yīng)或細(xì)胞氧化過(guò)程中核黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。從大的角度來(lái)說(shuō)，氧化應(yīng)激是指機(jī)體在受到體內(nèi)外各種不良因素刺激時(shí)，打破體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，引起體內(nèi)細(xì)胞凋亡或異常增生，從而誘導(dǎo)某種疾病的發(fā)生、發(fā)展[13]。

目前，抗氧化應(yīng)激信號(hào)通路中Keap1/Nrf2/HIF-1α通路最為常見(jiàn)。對(duì)于正常人而言，Keap1、Nrf2、HIF-1α均位于細(xì)胞質(zhì)中，且表達(dá)水平相對(duì)較低或不表達(dá)，二者相結(jié)合處于穩(wěn)態(tài)。Nrf2蛋白在泛素蛋白酶體途徑介導(dǎo)下降會(huì)不斷降解，造成Nrf2表達(dá)量較低[14]。但是，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生致病因素，如：致瘤因素刺激時(shí)，HIF-1α、Keap1部分結(jié)構(gòu)將會(huì)被修改，并且與Nrf2結(jié)構(gòu)部位構(gòu)象發(fā)生改變，持續(xù)引起Nrf2解離，造成信號(hào)通路失活[15]。本研究結(jié)果提示，宮頸癌組織中的HIF-1α、Nrf2、Keap1陽(yáng)性率，均高于癌旁組織的陽(yáng)性率（P<0.05）。免疫組化下Nrf2主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞核內(nèi)，部分位于胞質(zhì)內(nèi)，而HIF-1α、Keap1在宮頸癌組織中多表達(dá)于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，由此看出HIF-1α、Nrf2、Keap1在宮頸癌組織中陽(yáng)性率較高，能參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。HIF-1α在低氧狀態(tài)下表達(dá)水平較高，其基因結(jié)構(gòu)活躍，能迅速對(duì)低氧做出反應(yīng)，HIF-1α迅速積累，使細(xì)胞和機(jī)體能夠耐受低氧環(huán)境，這種對(duì)氧濃度變化的迅速的協(xié)同的反應(yīng)，對(duì)于機(jī)體具有顯著的保護(hù)意義[16-17]。本研究結(jié)果提示，宮頸癌組織中的Keap1/Nrf2/HIF-1α基因通路表達(dá)量，高于癌旁組織的表達(dá)量（P<0.05）。臨床研究表明，細(xì)胞在缺氧條件下產(chǎn)生的HIF-1α能與靶基因結(jié)合，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄，機(jī)理可能為：①能促進(jìn)紅細(xì)胞生成素的編碼基因[18];②能影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá);③能影響血紅素加氧酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的編碼[19];④能促進(jìn)葡萄糖載體蛋白、糖酵解酶表達(dá)水平。因此，臨床上可以加強(qiáng)Keap1/Nrf2/HIF-1α通路水平測(cè)定評(píng)估患者預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療[20]。但是，本研究中亦存在諸多不足，一方面，納入病例數(shù)較少，尚需要大樣本容量驗(yàn)證;另一方面，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理時(shí)存在較大的人為誤差，均需要進(jìn)一步研究與探討。

綜上所述，Keap1/Nrf2/HIF-1α通路在宮頸癌中呈表達(dá)，可能參與了宮頸癌疾病發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程。

[參考文獻(xiàn)]

[1]胡流芳，王迎，任汝靜，等.Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機(jī)制[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016， 43（1）：146-152.

[2]盧志剛，黃家彬，劉蕓，等.醒腦靜注射液對(duì)急性腦梗死Keap1-Nrf2/ARE氧化應(yīng)激通路的影響[J].廣東醫(yī)學(xué)，2016， 37（20）：3127-3129.

[3]Abu-Alainin W，Gana T，Liloglou T，et al.UHRF1 regulation of the Keap1-Nrf2 pathway in pancreatic cancer contributes to oncogenesis[J].J Pathol，2016，238（3）：423-433.

[4]馬瑤，白雪，李煜，等.混合砷對(duì)Keap1抑制細(xì)胞Keap1/Nrf2-ARE和MAPK/ERK信號(hào)通路的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2017，34（11）：999-1003.

[5]黃攀，陸瀚文，周崢嶸，等.Keap1、Nrf2和HO-1在大鼠應(yīng)激性胃潰瘍中的表達(dá)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（12）：280-282.

[6]劉理靜，錢(qián)紅，尹輝明，等.中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸通過(guò)激活Keap1/Nrf2信號(hào)通路增強(qiáng)肺纖維化大鼠抗氧化能力[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32（4）：479-483.

[7]韓倫，趙琳.Nrf2-Keap1信號(hào)通路對(duì)腫瘤生物學(xué)行為影響的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2016，56（36）：103-105.

[8]王換換，申正杰，肖航，等.熱應(yīng)激對(duì)肝臟中Keap1-Nrf2信號(hào)通路及下游基因表達(dá)的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（1）：151-156.

[9]Sun X，Ou Z，Chen R，et al.Activation of the p62-Keap1-NRF2 pathway protects against ferroptosis in hepatocellular carcinoma cells[J].Hepatology，2016，63（1）：173-184.

[10]吉琳梅，沈宏春，樊均明.NRF2通路在慢性腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥，2016，56（19）：100-102.

[11]黃娟，廖君，彭熙煒，等.腦泰方對(duì)腦缺血/再灌注大鼠海馬區(qū)Nrf2、HO-1和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2017，33（10）：1467-1472.

[12]王朝陽(yáng)，荊黎.核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2和Keap1的分子結(jié)構(gòu)和功能及其信號(hào)通路調(diào)控分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2016，30（5）：598-604.

[13]Best SA，Souza DPD，Kersbergen A，et al.Synergy between the KEAP1/NRF2 and PI3K pathways drives non-small-cell lung cancer with an altered immune microenvironment[J].Cell Metab，2018，27（4）：935.

[14]白美玲，郝秀輕，李峰，等.食管鱗狀上皮細(xì)胞癌中Keap1、Nrf2和HO-1的表達(dá)及臨床病理意義[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2016，32（8）：914-917.

[15]姬衛(wèi)秀，何詩(shī)依，嚴(yán)露，等.低氧、低氧訓(xùn)練對(duì)小鼠骨骼肌Nrf2/Keap1結(jié)合量和p-Nrf2表達(dá)的影響[J].中國(guó)體育科技，2017，53（4）：114-118.

[16]葉海主，陳亞娟，趙文英，等.腫瘤細(xì)胞和耐藥腫瘤細(xì)胞中FoxO3/Keap1/Nrf2通路的表達(dá)差異[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2017，22（8）：859-865.

[17]王宇鋒，劉旭，陳超，等.6-姜烯酚對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Keap1/Nrf2通路及下游基因表達(dá)的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，39（10）：1127-1132.

[18]馬瑤，白雪，李煜，等.混合砷對(duì)Keap1抑制細(xì)胞Keap1/Nrf2-ARE和MAPK/ERK信號(hào)通路的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2017，34（11）：999-1003.

[19]胡流芳，王迎，任汝靜，等.Keap1-Nrf2/ARE信號(hào)通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機(jī)制[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016，43（1）：146-152.

[20]王換換，申正杰，肖航，等.熱應(yīng)激對(duì)肝臟中Keap1-Nrf2信號(hào)通路及下游基因表達(dá)的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（1）：151-156.

（收稿日期：2018-10-22? 本文編輯：孟慶卿）