米諾環(huán)素對(duì)大鼠閉合性脊髓損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

黃雄偉業(yè)，張紹東，歷俊華，王彬彬，馮潔，劉松，萬(wàn)虹

首都醫(yī)科大學(xué)，北京市神經(jīng)外科研究所，北京市100070

急性脊髓損傷多由車(chē)禍、高空墜落等原因造成，導(dǎo)致患者長(zhǎng)期癱瘓，給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-2]。脊髓損傷由外傷引起脊髓橫斷或壓迫引起，可分為原發(fā)性損傷與繼發(fā)性損傷：原發(fā)性脊髓損傷是外力直接或間接作用于脊髓所造成的損傷；繼發(fā)性脊髓損傷是指在脊髓損傷后2~48 h發(fā)生的損傷，主要病理變化之一是離子失調(diào)和興奮性毒性物質(zhì)釋放。離子失調(diào)，特別是鈣離子濃度失調(diào)，可引發(fā)鈣蛋白酶活化、線(xiàn)粒體功能障礙和自由基生成，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡[3-4]。減輕繼發(fā)性損傷、防止其進(jìn)一步惡化，對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)非常重要[5]。

氯化鎂中的鎂離子為鈣離子的生理拮抗劑[6]，能減弱鈣超載所造成的細(xì)胞損傷，是公認(rèn)的神經(jīng)保護(hù)劑，廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)[7]。

米諾環(huán)素化學(xué)名為二甲胺四環(huán)素，是第二代半合成四環(huán)素類(lèi)藥物的衍生物，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、親脂性高、可通過(guò)血-腦屏障、口服易吸收的特點(diǎn)，作為抗生素可用于治療牙周炎、痤瘡等疾病[8-10]。長(zhǎng)期口服米諾環(huán)素?zé)o明顯不良反應(yīng)，安全性好[11]。米諾環(huán)素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有保護(hù)作用，可縮小損傷范圍，減輕軸突變性，加快運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[12]。本研究探討米諾環(huán)素在急性脊髓損傷中，對(duì)繼發(fā)性損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF雄性Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(190±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(京)2016-0011。適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d，室溫20~25℃，室內(nèi)光照，控制進(jìn)食和水。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到北京市神經(jīng)外科研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，審批文號(hào)201703004。

1.2 主要試劑與儀器設(shè)備

米諾環(huán)素、氯化鎂、聚乙二醇：英國(guó)ABCAM公司。苯巴比妥：法國(guó)CEVA公司。120602F壓迫水囊：FORGATY公司。Luxol Fast Blue(LFB)染色試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司。M400-E顯微外科手術(shù)顯微鏡：德國(guó)徠卡公司。Neuro-MEP-micr2電生理儀：俄羅斯NEUROSOFT公司。微量注射泵：北京普天益人醫(yī)療科技有限公司。T7.0動(dòng)物磁共振儀：德國(guó)BRUKER公司。

1.3 模型制備

水囊接三通，三通一端接改進(jìn)的胰島素注射器，另一端接大氣。管內(nèi)注入生理鹽水，排除氣泡，注入生理鹽水35 μl，觀察球囊膨大正常，抽出生理鹽水。

大鼠予苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉，俯臥，剃除背部毛發(fā)，確認(rèn)棘突最高位置為T(mén)10；背正中切口，暴露T13棘突和椎板，切除棘突，在T12-13間小心去除椎板；從T12后緣與脊髓平行向頭側(cè)插入水囊18 mm，注入鹽水35 μl；30 s后打開(kāi)三通，抽出水囊。分層縫合肌肉、筋膜和皮膚，置于溫箱中。大鼠蘇醒后單獨(dú)飼養(yǎng)2 d，然后合籠飼養(yǎng)。人工按摩腹部，直至恢復(fù)自主排尿、排便。

造模成功標(biāo)準(zhǔn)：觀察雙側(cè)下肢完全癱瘓，并立即行動(dòng)物磁共振檢查，影像學(xué)判定脊髓壓迫部位及損傷大小。剔除不成功者，并予補(bǔ)足。

1.4 動(dòng)物分組及給藥

大鼠造模前頸外靜脈置管。苯巴比妥1 ml/kg腹腔注射麻醉，頸部及相鄰背側(cè)備皮。大鼠仰臥，頸中線(xiàn)右側(cè)切口1 cm，暴露、分離頸外靜脈，置入自制留置輸液裝置，含有肝素的生理鹽水稀釋液封管。

造模成功的大鼠隨機(jī)分為鹽水組(n=8)、氯化鎂組(n=8)和米諾環(huán)素組(n=8)。分別稱(chēng)取93.75 mg(劑量 1)、68.75 mg(劑量 2)、25 mg(劑量 3)米諾環(huán)素粉末，溶于生理鹽水10 ml中，震蕩溶解。米諾環(huán)素組術(shù)后第1天予劑量1，第2天予劑量2，第3~7天每天予劑量3，每天13:00靜脈注射。氯化鎂組和鹽水組術(shù)后當(dāng)天7:00、15:00、23:00各注射相應(yīng)藥物1次，直至術(shù)后第7天。

所有大鼠均以2 ml/kg、0.05 ml/min通過(guò)靜脈留置管給藥。

1.5 Basso-Beattie-Bresnahan評(píng)分(BBB評(píng)分)

術(shù)后當(dāng)天開(kāi)始，前兩周每?jī)商爝M(jìn)行一次BBB評(píng)分[13]，之后每周兩次BBB評(píng)分，持續(xù)到術(shù)后第31天。大鼠置空曠平地上自由活動(dòng)，評(píng)分前適應(yīng)性活動(dòng)3 min，觀察活動(dòng)3 min進(jìn)行評(píng)分。分別對(duì)左右腿進(jìn)行評(píng)分，取均值。

1.6 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)

完成BBB評(píng)分后，各組5只大鼠10%水合氯醛1 ml/kg腹腔注射麻醉，背部胸腹段及大腿備皮，俯臥位置于鼠板上，刺激電極置入硬腦膜外側(cè)，接收電極置于腓腸肌，地線(xiàn)插入背部皮內(nèi)，單次電信號(hào)刺激，1 Hz、0.1 ms方波，強(qiáng)度25~30 mA，接收電極記錄振幅，至少3次以上重復(fù)性好時(shí)，記錄保存。

1.7 感覺(jué)誘發(fā)電位檢測(cè)

各組取4只大鼠，麻醉及皮膚處理同上。切開(kāi)背部皮膚，暴露棘突，找到損傷的椎骨，去除椎板，暴露T9脊髓，將接收電極從背側(cè)椎間隙插入到脊髓和椎骨間，明膠海綿固定。分離坐骨神經(jīng)，將刺激電極插入坐骨神經(jīng)主干，地線(xiàn)插入背部皮內(nèi)，重復(fù)電信號(hào)刺激，1 Hz、0.2 ms方波，強(qiáng)度4.5 mA，疊加50~100次，接收電極記錄振幅，至少3次以上重復(fù)性好時(shí)，記錄保存。

1.8 LFB染色

電生理檢測(cè)后，各組取3只大鼠4%多聚甲醛心臟灌注固定處死，取T9-11脊髓，4%多聚甲醛中后固定，脫水、浸蠟、包埋，切片，厚4 μm。常規(guī)脫蠟、入水，置95%乙醇中，加LFB染色液，室溫20 h。95%乙醇洗去多余染色液，蒸餾水沖洗，入Luxol液分色15 s，入70%乙醇分色30 s至灰白質(zhì)清晰；蒸餾水沖洗，伊紅復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。ImageScope軟件掃描損傷面積最大、兩端含有正常脊髓結(jié)構(gòu)的切片，Image J軟件通過(guò)陽(yáng)性區(qū)域閾值圈定范圍方式計(jì)算染色陽(yáng)性區(qū)域面積。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 磁共振檢查

選造模術(shù)后雙下肢完全癱瘓、BBB評(píng)分為0的大鼠行磁共振檢查。冠狀位和水平位可見(jiàn)T2低信號(hào)，脊髓組織受壓、萎縮，周?chē)[(圖1)。

2.2 BBB評(píng)分

三組BBB評(píng)分均隨時(shí)間的推移逐漸增高。術(shù)后第2~14天組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后第17~31天米諾環(huán)素組高于鹽水組(P<0.05)，氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位

米諾環(huán)素組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位振幅高于鹽水組(P<0.05)，氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

圖1 磁共振T2加權(quán)像

表1 各組大鼠BBB評(píng)分比較

2.4 感覺(jué)誘發(fā)電位

各組間感覺(jué)誘發(fā)電位振幅無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖3、表3。

2.5 LFB染色

米諾環(huán)素組損傷面積低于鹽水組(P<0.05)，氯化鎂組與鹽水組和米諾環(huán)素組之間均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)圖4、表4。

表2 各組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位比較(μV)

表3 各組感覺(jué)誘發(fā)電位比較(μV)

表4 各組損傷面積比較比較(mm2)

圖2 各組運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位波形圖

圖3 各組感覺(jué)誘發(fā)電位波形圖

圖4 各組損傷區(qū)域面積(LFB染色,bar=500 μm)

3 討論

目前有多種制備脊髓損傷動(dòng)物模型的方法，如重物墜落法脊髓挫傷模型、脊髓半橫斷或全橫斷損傷模型、牽拉性脊髓損傷模型等[14-16]，這些動(dòng)物模型都為開(kāi)放性脊髓損傷，需手術(shù)去除椎骨和椎板，完全暴露脊髓，這種損傷方式臨床不可能發(fā)生。為了模擬臨床上常見(jiàn)的閉合性脊髓急性損傷[17]，我們開(kāi)發(fā)球囊壓迫大鼠脊髓背側(cè)急性損傷動(dòng)物模型。此模型下，脊髓損傷面積和治療空間保持穩(wěn)定，有利于病理生理變化的觀察。我們還研發(fā)了一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用靜脈留置輸液裝置，現(xiàn)已申報(bào)發(fā)明專(zhuān)利。

電生理是一種用于評(píng)價(jià)神經(jīng)傳導(dǎo)功能的檢測(cè)手段，振幅越高，神經(jīng)傳導(dǎo)功能越好[18-19]。本研究顯示，運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位振幅鹽水組最低，米諾環(huán)素組最高，氯化鎂組介于兩者之間，與BBB評(píng)分結(jié)果相似。說(shuō)明脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)與運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測(cè)結(jié)果相符。而感覺(jué)誘發(fā)電位振幅各組間無(wú)顯著性差異，可能由于米諾環(huán)素主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，末梢感受器中濃度不高，作用不明顯。有待進(jìn)一步研究。

米諾環(huán)素具有能穿過(guò)血腦屏障、口服易吸收以及神經(jīng)保護(hù)作用的特點(diǎn)，被用于諸多神經(jīng)系統(tǒng)性疾病的治療研究中[20]。Wells等[21]首次報(bào)道，米諾環(huán)素對(duì)急性開(kāi)放性脊髓損傷有保護(hù)作用，可縮小脊髓損傷范圍，減輕軸突變性，加快運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。Teng等[22-23]報(bào)道，米諾環(huán)素對(duì)急性挫裂性脊髓損傷有治療作用，不僅可通過(guò)減少線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C的釋放而減少細(xì)胞凋亡，還可加速大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)。Aras等[24]發(fā)現(xiàn)，米諾環(huán)素對(duì)大鼠開(kāi)放性脊髓損傷的保護(hù)作用與其抗氧化激活機(jī)制有關(guān)。

由于米諾環(huán)素具有良好的脂溶性和能夠穿過(guò)血腦屏障，我們選擇緩慢持續(xù)靜脈給藥方式，使藥物在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定的血藥濃度；由于米諾環(huán)素代謝排出率較低，大部分在體內(nèi)滯留，因此采用不同藥物濃度階梯給藥，后續(xù)僅需維持血藥濃度即可。這種給藥方式符合藥理學(xué)規(guī)律，也貼合臨床實(shí)際。

目前人們分別從神經(jīng)功能恢復(fù)、電生理檢測(cè)以及抗凋亡等方面，證明米諾環(huán)素對(duì)脊髓急性損傷具有保護(hù)作用[24-25]。本研究顯示，米諾環(huán)素和氯化鎂一樣，在脊髓急性損傷后可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，增強(qiáng)神經(jīng)傳導(dǎo)，減少繼發(fā)性損傷面積。為今后臨床藥物開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。