新劑型藥物血漿中游離藥物濃度研究方法概述

摘 要 新劑型藥物改善了血漿中游離藥物濃度比率，從而降低毒性提高藥效，因而檢測(cè)血漿中游離藥物濃度具有重要意義。新劑型藥物游離濃度測(cè)定和藥物血漿蛋白結(jié)合率測(cè)定有一定差別，主要在于新劑型藥物引入的新的外源性蛋白（或其他影響藥物游離率的輔料），存在血漿中蛋白特異性差異大、蛋白濃度變化大和游離藥物濃度較低三方面問(wèn)題。因而一般血漿蛋白結(jié)合率試驗(yàn)的方法不一定都適用于新劑型藥物游離濃度測(cè)定。本文就常見(jiàn)的游離藥物濃度測(cè)定方法（超速離心法、超濾法、平衡透析法和快速平衡透析法）及其優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍做一個(gè)概要介紹，為新劑型藥物的研發(fā)提供幫助。

關(guān)鍵詞 游離藥物濃度 超速離心 超濾 平衡透析

中圖分類號(hào)：R969.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2019）07-0074-04

Summary of research methods for free concentration of new dosage forms drug in plasma

MA Zhiyu*

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT New dosage forms such as albumin binding and micelles can improve the solubility and targeting of drugs， reduce the adverse drug reactions drugs and increase the dose tolerance. These are all achieved by improving the ratio of free drug concentration in plasma， so it is important to determinate the concentration of free drug in plasma. In this paper， the common methods such as ultracentrifugation， ultrafiltration， equilibrium dialysis and rapid equilibrium dialysis for the determination of free drug concentration and their advantages and disadvantages and the scope of application are briefly introduced so as to provide assistance for the development of new dosage forms.

KEY WORDS free drug concentration； ultracentrifugation； ultrafiltration； equilibrium dialysis

近年來(lái)，隨著藥物新劑型的不斷發(fā)展創(chuàng)新，許多如紫杉醇一類的溶解度差的、毒性大的藥物越來(lái)越多被制成了白蛋白結(jié)合型、膠束等新劑型。這些新劑型增加了藥物的溶解性和靶向性，從而降低藥物本身及其助溶劑帶來(lái)的不良反應(yīng)，提高給藥耐受劑量從而增加療效，并通過(guò)緩釋延長(zhǎng)藥物半衰期以延長(zhǎng)給藥間隔，提高患者的用藥依從性。而以上這些優(yōu)勢(shì)，都是因?yàn)樾聞┬透淖兞怂幬镌谘獫{中游離比才實(shí)現(xiàn)的[1-3]。

眾所周知，藥物進(jìn)入體循環(huán)發(fā)揮藥效，需在體內(nèi)溶解和吸收。藥物吸收進(jìn)入血液后，存在兩種狀態(tài)，一種是血漿蛋白結(jié)合型，一種是血漿蛋白未結(jié)合型（即游離型）。而藥物在體內(nèi)的組織分布方式，主要是由血漿中游離藥物完成的。因此，研究游離藥物濃度，對(duì)評(píng)價(jià)新劑型藥物的藥效和毒性都具有重要意義[4-6]。

雖然研究新劑型藥物的游離藥物濃度和研究藥物血漿蛋白結(jié)合率有一定相似之處，但也有明顯差別：①新劑型藥物中往往含有外源性白蛋白之類助溶或靶向作用輔料，與人體內(nèi)源性血漿蛋白會(huì)有一點(diǎn)差異；②新劑型藥物在體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率往往隨著給藥后時(shí)間而變化，這是由于外源性白蛋白逐漸被降解，藥物釋放改變或藥物周邊蛋白濃度改變?cè)斐傻模虎塾坞x藥物濃度往往比較低，常常小于1 ng/ml。故許多適用于蛋白結(jié)合率測(cè)定的方法，諸如毛細(xì)管電泳、圓二色譜法等，由于蛋白特異性差異大、蛋白濃度變化大和游離藥物濃度較低的問(wèn)題，并不適用測(cè)定游離濃度[7-9]。

目前用于測(cè)定血漿中游離藥物濃度的處理方法主要有以下四種：超速離心法、超濾法、平衡透析法和快速平衡透析法。本文將對(duì)這四種常見(jiàn)方法進(jìn)行詳細(xì)概述，為游離藥物濃度的測(cè)定提供幫助，從而為新劑型藥物的研究和毒性評(píng)價(jià)提供幫助。

1 超速離心法

即含藥物的血漿樣品放專用的離心管中，用超速離心機(jī)于100 000 g、37 ℃離心15 h。離心后取上清液測(cè)定。

此方法優(yōu)點(diǎn)為：①操作步驟簡(jiǎn)單，直接取樣離心即可；②由于樣品不經(jīng)過(guò)任何膜，僅在離心管中，故不存在樣品吸附問(wèn)題。其缺點(diǎn)也較為明顯：①由于樣品需要在37 ℃下離心15 h，故血漿應(yīng)在37 ℃、15 h內(nèi)穩(wěn)定；②需要借助昂貴的專用的超速離心機(jī)，且每次只能離心10～24個(gè)左右樣品，每次離心需要15 h，對(duì)于擁有大量樣品的藥動(dòng)學(xué)和等效性試驗(yàn)不適用；③由于新劑型中存在白蛋白之類非血漿內(nèi)源性蛋白，離心后的血漿樣品存在一個(gè)濃度梯度，即最下層為結(jié)合蛋白的藥物，最上層為游離藥物，而中間層則兩種狀態(tài)藥物都存在。故在最終取樣測(cè)定時(shí)，取樣位置會(huì)顯著影響測(cè)定結(jié)果。

此方法適用于血漿穩(wěn)定性好、樣品數(shù)量少、用其他方法會(huì)存在吸附藥物的游離濃度測(cè)定。r（游離藥物）=最上層游離藥物濃度[10-11]。

2 超濾法

即在超濾膜樣品側(cè)加入含藥物的血漿，用離心力之類外力使血漿部分通過(guò)超濾膜（于37 ℃離心），超濾膜有特定的分子質(zhì)量截止值（如30 kDa），最終游離的藥物進(jìn)入超濾膜的另一側(cè)，而蛋白結(jié)合型的藥物則留在樣品側(cè)。

此方法的優(yōu)點(diǎn)如下：①超濾膜裝置相對(duì)于超速離心機(jī)易于獲得，且價(jià)格相對(duì)便宜；②樣品制備時(shí)間短，通常一次約20 min左右，適用于大量樣品測(cè)試；③由于制備時(shí)間短，適合血漿穩(wěn)定性較差的藥物。其缺點(diǎn)如下：①不適用于吸附性藥物，即藥物若在超濾膜上吸附，則該方法不適用；②超濾膜使用前需活化，相對(duì)比較麻煩；③不同廠家和材料的超濾膜重現(xiàn)性相對(duì)較差。

此方法應(yīng)用的前提是藥物在超濾膜上不被吸附。若樣品吸附性驗(yàn)證通過(guò)，且對(duì)藥物血漿穩(wěn)定性的要求較低，可用于大量樣品的測(cè)試。r（游離藥物）=濾過(guò)層的藥物濃度[9-15]。

3 平衡透析法

即用平衡透析膜分開(kāi)等體積的含藥物血漿和緩沖液，由于平衡透析膜有特定的分子質(zhì)量截止值（如30 kDa）。通過(guò)24 h（37 ℃）平衡孵化，蛋白結(jié)合型藥物無(wú)法通過(guò)透析膜，而游離型藥物側(cè)分布到了緩沖液一側(cè)。

此方法的優(yōu)點(diǎn)如下：①平衡透析法為游離藥物測(cè)定最基本的方法，因此測(cè)定結(jié)果最能體現(xiàn)游離藥物濃度。②平衡裝置相對(duì)經(jīng)濟(jì)便宜，平衡透析膜也比較常見(jiàn)。缺點(diǎn)如下：①孵化時(shí)間長(zhǎng)，需24 h，不適合血漿穩(wěn)定性差的藥物；②因時(shí)間長(zhǎng)，且每次孵化樣品量少，故不適合大量樣品的測(cè)試；③由于樣品要接觸透析膜，故不適合吸附性強(qiáng)的藥物；④透析膜廠家和材質(zhì)較多，不同透析膜對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有影響；⑤透析膜使用前需活化。

此方法需化合物血漿穩(wěn)定性好，樣品在透析膜上不吸附，且只適用于少量樣品。r（游離藥物）=緩沖液層的藥物濃度[7-11， 16-19]。

4 快速平衡透析儀法

即用快速平衡透析儀進(jìn)行游離藥物的測(cè)定。是平衡透析法的改進(jìn)版，由于渦旋力存在和透析面積的擴(kuò)大，平衡透析時(shí)間從24 h縮短至4 h。透析膜兩側(cè)，即血漿樣品側(cè)和緩沖液側(cè)的試驗(yàn)加入體積不同，目的在于扣除藥物吸附的問(wèn)題。

此方法的優(yōu)點(diǎn)如下：①此裝置一次可以制備48個(gè)樣品，且孵化時(shí)間僅為4 h，適用于大量樣品測(cè)試；②該儀器兩側(cè)（血漿和緩沖液）體積不同，已排除吸附干擾，故適合吸附性強(qiáng)藥物；③孵化時(shí)間相對(duì)短，且最終計(jì)算方式為測(cè)定兩側(cè)濃度，已扣除穩(wěn)定性干擾，故適合血漿穩(wěn)定性差的藥物；④該透析膜已經(jīng)批量生產(chǎn)，試驗(yàn)溫度和CO2濃度固定，故其重現(xiàn)性較好；⑤該透析膜可同時(shí)測(cè)定已知結(jié)果的陽(yáng)性藥物作為對(duì)照，保證試驗(yàn)過(guò)程的可靠性。缺點(diǎn)如下：①快速平衡透析膜為消耗品，單個(gè)膜價(jià)格相對(duì)較高；②需要使用專門的孵化設(shè)備和快速平衡透析儀。

此方法適合大多數(shù)藥物游離濃度測(cè)定，但需要專門的儀器設(shè)備。r（游離藥物）=藥物血漿總濃度×（緩沖液層的藥物濃度/血漿層藥物濃度×100%）[20-24]。

5 結(jié)語(yǔ)

目前常用的測(cè)定游離藥物濃度的方法的優(yōu)缺點(diǎn)如上所述，可根據(jù)不同藥物的特點(diǎn)和試驗(yàn)條件進(jìn)行選擇。在進(jìn)行選擇之前，我們應(yīng)了解是否有特殊設(shè)備、藥物本身的血漿穩(wěn)定性（37 ℃）、吸附性和待測(cè)樣品的數(shù)量。每種方法的適用范圍見(jiàn)表1。

游離藥物濃度的檢測(cè)對(duì)于新劑型藥物的臨床用藥、藥效評(píng)價(jià)、安全性監(jiān)測(cè)等都有重要意義，而更準(zhǔn)確實(shí)用的游離藥物濃度測(cè)定方法也將對(duì)新劑型藥物的研發(fā)提供重要依據(jù)。

致謝：對(duì)中科院上海藥物研究所藥物代謝研究中心的全體領(lǐng)導(dǎo)、同事和學(xué)生對(duì)此綜述的完稿所提供的幫助表示衷心感謝！

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