原料乳及乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法

楚雪

眾所周知，三聚氰胺是一種常見的工業(yè)原料，在紡織、橡膠、塑料等行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，而且它的含氮量極高，如果添加到原料乳以及乳制品中，可以造成數(shù)據(jù)假象，讓人們誤以為里面含有較多的蛋白質(zhì)成分。

典型的三聚氰胺檢測(cè)方法

三聚氰胺是一種無色無味的晶體，低毒，微溶于乙醇，可溶于甲醇、甘油、乙酸，不溶于乙醚、苯酚。目前，三聚氰胺的主要用途是加工塑料、膠水、涂料和阻燃劑。雖然三聚氰胺毒性較低，但是對(duì)于幼兒而言，如果一次性攝入量過多，就會(huì)導(dǎo)致腎功能衰竭。我國(guó)明確規(guī)定嬰幼兒配方奶粉中三聚氰胺的含量不得超過1.0mg/L，其他食品中三聚氰胺的含量不得超過2.0mg/L。

色譜檢測(cè)。第一種，高效液相色譜法。這種方法簡(jiǎn)稱HPLC法，適用的范圍特別廣，而且分析速度很快，能夠?qū)崿F(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)，是最普遍的檢測(cè)方法。目前人們已經(jīng)加大了研究的力度，并且對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，明顯縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且高效液相色譜法日漸成熟，已經(jīng)成為了人們檢測(cè)三聚氰胺的首選方法，具體的檢測(cè)內(nèi)容會(huì)在本文的第二章節(jié)詳細(xì)介紹。第二種，氣相色譜質(zhì)譜法。這種方法簡(jiǎn)稱GC- MS法，靈敏度很高，但是由于三聚氰胺的分子質(zhì)量較小，不容易揮發(fā)，所以需要進(jìn)行衍生處理，提高揮發(fā)性，這一過程會(huì)造成一定的樣品損失。如果使用硅烷進(jìn)行衍生處理，可以降低外界環(huán)境的干擾，而結(jié)合反吹技術(shù)，可以省略固相萃取柱凈化的環(huán)節(jié)，這樣簡(jiǎn)化了處理流程。第三種，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。這種方法使用三氯乙酸溶液對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行提取，然后通過離子固相萃取柱凈化，在對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，方法檢測(cè)低限為18μg/kg，與上述兩種方法相比，這種方法更加便捷，并且可以使用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測(cè)量。

光譜檢測(cè)。第一種，拉曼法。SERS技術(shù)可以增強(qiáng)金屬表面附著物質(zhì)的散射信號(hào)，并且搜集到具體的結(jié)構(gòu)信息，所以檢測(cè)人員可以建立一套拉曼光譜掃描系統(tǒng)，對(duì)原料乳與三聚氰胺顆粒的混合樣本進(jìn)行檢測(cè)，就會(huì)發(fā)現(xiàn)拉曼強(qiáng)度與三聚氰胺的比例存在明顯的線性關(guān)系。在具體的檢測(cè)過程中，需要事先對(duì)原料乳以及乳制品的樣品進(jìn)行提取，使用三氯乙酸溶液，濃度在13%左右，這樣能夠除去樣品中的氧化鋁雜質(zhì)，然后再進(jìn)行SERS檢測(cè)，這樣可以極大地縮短檢測(cè)時(shí)間。第二種，紅外法。紅外光譜技術(shù)不會(huì)對(duì)樣品造成破壞，所以可以算作綠色技術(shù)，這種技術(shù)能夠?qū)悠愤M(jìn)行定量分析，即使不斷變化樣品中三聚氰胺的濃度，也可以很好地識(shí)別未知樣品中三聚氰胺的真實(shí)含量。第三種，熒光法。這種方法需要利用還原劑將膽酸鈉合成為AuNCs，而三聚氰胺遇到AuNCs后，會(huì)增強(qiáng)熒光的效果，這種方法操作比較簡(jiǎn)單，人們可以用它對(duì)超市中出售的牛奶進(jìn)行檢測(cè)。另外，還可以使用試紙條對(duì)三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)，而且便于肉眼觀察，檢測(cè)時(shí)間大概15分鐘左右。

免疫檢測(cè)。目前，免疫檢測(cè)方法不是十分常見，而且涉及到免疫反應(yīng)，核心原理是抗原抗體的特異性結(jié)合，并且需要借助大孔徑的微孔過濾膜。在制作三聚氰胺抗原時(shí)，要使用活化脂法，然后將三聚氰胺抗體以及HRP抗體作為檢測(cè)層，這種方法耗時(shí)較短。

高效液相色譜法簡(jiǎn)析

試驗(yàn)。使用的材料包括甲醇、氨水、三氯乙酸、檸檬酸、辛烷磺酸鈉以及乙酸鉛。將50mL的甲醇注入到含有50mL水的試管中，得到甲醇水溶液。用天平稱取10g的三氯乙酸，然后放入到1L的容量瓶中，之后用水將容量瓶注滿，并且進(jìn)行均勻的晃動(dòng)，得到濃度為1%的三氯乙酸溶液。將5mL的氨水與95mL的甲醇混合在一起，得到濃度為5%的氨化甲醇溶液。將1g乙酸鉛放入到100mL的容量瓶?jī)?nèi)，然后注滿水，得到1%的乙酸鉛溶液。這里需要注意的是離子對(duì)試劑緩沖液的配制，需要將2.05g的檸檬酸鈉與2.18g的辛烷磺酸鈉混合在一起，然后加入960mL的水，混合均勻后還要加水調(diào)節(jié)PH，當(dāng)PH達(dá)到3.2時(shí)，停止加水。

使用的儀器包括高效液相色譜儀、天平、固相萃取裝置、氮?dú)獯蹈蓛x等，在配制三聚氰胺儲(chǔ)備液時(shí)，需要準(zhǔn)確稱取0.09966g含量為99.98%的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，并且與甲醇水溶液混合在一起，這樣就得到了濃度為986.324μg/ mL的儲(chǔ)備液，保存時(shí)要注意避光，同時(shí)溫度控制在6℃左右。在試驗(yàn)過程中，分別選取0.06mL、0.15mL、3mL以及6mL的儲(chǔ)備液，進(jìn)行分組，并且放入到100mL的容量瓶中，用流動(dòng)相定容，根據(jù)濃度的高低進(jìn)行檢測(cè)。HPLC的檢測(cè)條件：色譜柱Kromasil100- 5- C18，流速1.2mL/min，柱溫38℃，波長(zhǎng)230nm。如果調(diào)節(jié)流動(dòng)相PH，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)PH下降時(shí)，目標(biāo)峰拖尾情況出現(xiàn)的次數(shù)明顯降低，所以可以在2.3～3.6之間合理調(diào)節(jié)PH。這里需要注意的是，試驗(yàn)過程會(huì)使用蛋白沉降劑，乙酸鉛可以保證沉降效果符合要求，而使用其他物質(zhì)，會(huì)發(fā)現(xiàn)儲(chǔ)備液十分混濁，經(jīng)過離心機(jī)處理后，過濾速度沒有明顯提升。

結(jié)論。三聚氰胺的線性回歸方程為：Y= 81936.5X+36579.1，R=0.99999682，對(duì)同一樣品進(jìn)行8次檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺的含量基本一致，8次檢測(cè)的結(jié)果分別是52.6、52.6、52.6、52.4、52.4、52.5、52.5、52.4，平均值52.5。當(dāng)室溫在28℃時(shí)，將流動(dòng)相PH調(diào)節(jié)至3.2，可以發(fā)現(xiàn)拖尾情況不是十分明顯，對(duì)不同的PH進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，可以發(fā)現(xiàn)當(dāng)PH在2.9時(shí)，目標(biāo)峰的拖尾現(xiàn)象完全消失，不同PH出峰時(shí)間和出峰面積如表1所示。

至于離子對(duì)緩沖液，黏度越小，阻抗就越小，所以出峰時(shí)間也越短，而且不會(huì)影響出峰的面積，流動(dòng)相的比例可以是90+10，也可以是60+40，70+30，80+20，但是需要注意的是，黏度小到一定程度后，出峰時(shí)間不會(huì)繼續(xù)縮短，經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，比例為75+25時(shí)，出峰迅速并且目標(biāo)峰的面積穩(wěn)定。這里我們還有注意一下回收率的問題，也就是將乙酸鉛與乙腈相互調(diào)換，比如A、B、C三只試管注入25mL的三氯乙酸溶液和10mL的乙酸鉛溶液，而D、E和F三只試管注入25mL的三氯乙酸溶液和10mL的乙腈溶液，對(duì)這6支試管進(jìn)行進(jìn)行檢測(cè)，觀察儲(chǔ)備液沉淀情況，發(fā)現(xiàn)A、B和C試管中儲(chǔ)備液的回收率平均值達(dá)到了96.29%，而D、E和F試管中儲(chǔ)備液的回收率平均值為90.36%，所以乙酸鉛作為沉淀劑的效果比較突出。

綜上所述，人們的日常生活需要消耗大量的原料乳及乳制品，如果它們中含有三聚氰胺，那么就會(huì)嚴(yán)重威脅人們的身體健康，所以做好三聚氰胺的檢測(cè)工作大有裨益。但是任何檢測(cè)方法都不能保證萬無一失，還需要具體情況具體分析，并且不斷改進(jìn)和優(yōu)化。