河南石斛游離氨基酸超聲輔助提取工藝條件的優(yōu)化

郭 旭， 陳乃東， 陳乃富， 張艷晴， 王榮花， 徐文冬， 石敏珠

(1.皖西學院， 安徽 六安 237012； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學 士官學校， 河北 石家莊 050083)

游離氨基酸是指天然產(chǎn)物中以游離狀態(tài)存在的氨基酸，是一種重要生物活性物質[1]，具有維護新陳代謝、促進生長、增強免疫等功能[2-4]，在食品、藥品及藥用植物中廣泛存在，是中藥治療疾病或滋補營養(yǎng)的主要成分之一，是評價中藥材或食品品質的一項重要指標。河南石斛(Dendrobiumhenanense)屬于蘭科石斛屬[5]，具有益胃生津、滋陰清熱的功效[6]，具有很高的藥用和觀賞價值[7]。然而，對于河南石斛化學成分的研究尚處于起步階段。為此，筆者等以河南石斛中游離氨基酸的提取得率為評價指標，對其游離氨基酸的超聲輔助提取工藝條件進行篩選，為河南石斛藥效物質基礎研究及資源開發(fā)利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1石斛于2018年4月采自安徽省霍山縣，經(jīng)鑒定為河南石斛(Dendrobiumhenanense)。

1.1.2儀器電子分析天平(FA1004型，上海精科有限公司)、BenchTop Pro冷凍干燥機(SP Scientific，USA)、雙光束紫外可見分光光度計(TU-1901型，北京普析通用儀器有限責任公司)、超聲波清洗儀(東莞市協(xié)和超聲波設備有限公司)等。

1.1.3試劑甘氨酸(石家莊東華金龍化工有限公司)、磷酸二氫鉀(廣東省精細化學品工程技術研究開發(fā)中心)、氫氧化鈉(西隴科學股份有限公司)、茚三酮(上海恒遠生物科技有限公司)、無水乙醇(江蘇強盛功能化學股份有限公司)等均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1甘氨酸標準曲線的制備分別精密量取1.0 mg/mL甘氨酸溶液0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于刻度試管中，以蒸餾水補足至10.0 mL。吸取上述各溶液2.0 mL于10 mL刻度試管中，分別加入2%茚三酮溶液1.0 mL和pH 6.8的磷酸緩沖液1.0 mL，震蕩搖勻，于100℃水浴中加熱15 min后冷卻，蒸餾水定容至刻度，以0.0 mg/mL甘氨酸為空白對照，在570 nm波長下測定吸光度，測得標準曲線方程：A=16.34C+0.034，R2=0.991，式中，A為吸光度，C甘氨酸標準品質量濃度。

1.2.2提取工藝條件單因素試驗取河南石斛新鮮莖，洗凈、切片，-50℃冷凍干燥至恒重，粉碎。在預試驗的基礎上，用60%甲醇為提取劑[8-10]，固定超聲提取溫度為60℃，精密稱取0.5 g干燥至恒重的河南石斛粉末若干份，按表1設計進行單因素試驗，3次重復，考察超聲提取時間、超聲提取功率、料液比和超聲提取次數(shù)對河南石斛游離氨基酸提取得率的影響。

表1不同因素提取河南石斛游離氨基酸的試驗設計及水平

1.2.3提取工藝條件響應面試驗根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，選取料液比、超聲提取時間、超聲提取功率、超聲提取次數(shù)4個影響因素，以河南石斛中游離氨基酸的提取得率為響應值(y)，根據(jù)單因素試驗結果進行4因素3水平(表2)響應面分析試驗，根據(jù)試驗結果進行數(shù)學建模，確定超聲波輔助提取的最佳工藝條件。響應面試驗設計和分析采用Design-Expert10.0完成，最后進行最佳工藝條件的驗證和加樣回收試驗。

1.2.4游離氨基酸提取得率的測定精密吸取1.2.2、1.2.3所述試驗條件下提取的河南石斛提取液1.0 mL置于10.0 mL刻度試管中，按標準曲線的制備方法在570 nm處測定吸光度，代入標準曲線計算提取液中游離氨基酸濃度，進而計算出游離氨基酸的提取得率。

表2不同因素提取河南石斛游離氨基酸響應面試驗設計的因素與水平

2結果與分析

2.1單因素試驗

從圖1可看出超聲提取時間、超聲提取功率、料液比和超聲提取次數(shù)對河南石斛總游離氨基酸提取得率的影響。

2.1.1料液比河南石斛游離氨基酸的提取得率隨著料液比的增加而增大，料液比為1∶50時達到最大值，但料液比為1∶40和1∶50時游離氨基酸的提取得率差異無統(tǒng)計學意義，故選擇料液比1∶(20～40)做響應面優(yōu)化。

2.1.2超聲提取時間當超聲提取時間≤40 min時，隨著提取時間延長河南石斛游離氨基酸的提取得率顯著升高；超過40 min后，隨著提取時間延長提取得率差異不顯著，超聲時間30 min時河南石斛粉末中游離氨基酸已基本被提取出來，故選擇超聲提取時間20～40 min為后續(xù)優(yōu)化的提取時間。

2.1.3超聲提取功率隨著超聲提取功率的增加河南石斛游離氨基酸的提取得率逐漸增加，超聲提取功率為240 W時達最大值，繼續(xù)加大超聲提取功率，提取得率下降。原因可能是超聲提取功率≤240 W時，超聲功率增加有利于粉末中游離氨基酸的溶出，但繼續(xù)增大超聲功率，提取液的流動速度加快，造成粉末在超聲場中停留時間減少，導致破壁作用減弱[11]。綜合考慮，選擇超聲提取功率120～240 W做進一步響應面優(yōu)化試驗。

2.1.4提取次數(shù)隨著提取次數(shù)的增加河南石斛游離氨基酸的提取得率不斷增大，在提取4次時基本達到穩(wěn)定，再增加提取次數(shù)無顯著差異，故選2～4次做進一步響應面優(yōu)化試驗。

圖1不同因素下河南石斛總游離氨基酸的提取得率

2.2響應面試驗

采用Design-Expert 10.0軟件對響應面試驗結果(表3)進行回歸擬合，得回歸方程：

y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2

經(jīng)方差分析(表4)，在各因素所選取的水平范圍內(nèi)，B、C、D、BC、BD、A2、B2、C2、D2所對應的P值均小于0.05，說明這幾個因素對河南石斛游離氨基酸的提取得率有顯著影響。根據(jù)F值大小可知，4個因素對河南石斛提取得率的影響為提取功率(C)>提取時間(B)>提取次數(shù)(D)>料液比(A)。

經(jīng)Design-Expert 10.0軟件分析，以60%乙醇體積為提取劑、超聲提取溫度60℃時，超聲波輔助提取河南石斛游離氨基酸的最佳工藝條件為料液比1︰39.85(g︰mL)、超聲時間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)3.7次。在此條件下，預測的河南石斛中游離氨基酸含量為1.979%?？紤]實際操作條件，將條件定為料液比1︰40、超聲時間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)4次。

表3河南石斛游離氨基酸提取響應面試驗結果

注：實測值為3次重復試驗的平均值。

Note:Measured value is the mean value of three repetitions.

表4響應面試驗方差分析結果

2.3最佳工藝條件的驗證

2.3.1驗證試驗在最佳條件下進行驗證試驗，河南石斛的游離氨基酸含量為(1.95±0.12)%，與理論值相近，說明響應面法優(yōu)化得到的工藝條件相對可靠。

2.3.2加樣回收試驗精密稱取河南石斛樣品6份，各0.5 g，分別加入甘氨酸10.0 mg，按最佳工藝條件提取，計算回收率和RSD，測得加樣回收率在94.2%～103.5%，RSD=4.2%，加標回收率滿足試驗要求，表明本測定方法穩(wěn)定可靠。

3結論

在單因素試驗基礎上利用響應面法，通過二次回歸計算構建河南石斛游離氨基酸提取得率與超聲提取時間、超聲提取功率、料液比、超聲提取次數(shù)關系的回歸模型，回歸方程：y=-4.242-0.022 2A+0.107 9B+0.017 1C+1.088D-0.000 025AB+0.000 017AC-0.001 25AD-0.000 096BC-0.005 25BD-0.000 75CD+0.000 4A2-0.000 76B2-0.000 02C2-0.079 7D2，R2=0.989 9，利用模型對影響超聲波輔助提取河南石斛游離氨基酸的4個關鍵因素及其相互作用進行分析，得到最佳提取條件為料液比1︰40(g︰mL)、超聲時間30 min、超聲功率240 W、提取次數(shù)4次，在此條件下河南石斛的游離氨基酸含量為(1.95±0.12)%。