運(yùn)用Plackett-Burnman設(shè)計(jì)和Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化地榆沒食子酸提取工藝

唐遠(yuǎn)江， 余 波， 劉 鏡， 周思璇， 張 濤， 盧昱希

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005；2.貴州宏宇畜牧技術(shù)發(fā)展有限公司，貴州 貴陽(yáng) 550005)

地榆(SanguisorbaofficinalisL)是薔薇科(Rosaceae)地榆屬(SanguisorbaLinn)植物，多年生草本，高30～120 cm，中生植物[1]。地榆的花、莖葉、根分別含有多種化學(xué)成分。槲皮素、山奈素苷、熊果酸、維生素等是莖葉的主要成分；花中主要含矢車菊苷、矢車雙菊苷、楊梅苷、花青苷、無(wú)色花青苷黃酮醇以及兒茶素等；根中有鞣質(zhì)(17%)和三萜皂苷(2.4%～4.0%)，還有黃酮、蒽醌、甾體類等化學(xué)成分[2]。俞浩等[3-4]研究表明，地榆中的鞣質(zhì)具有止血作用。體外抑菌試驗(yàn)表明，地榆能有效抑制溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草桿菌的生長(zhǎng)[5]，地榆水提取液及醇提取液能明顯抑制正常大鼠甲醛性足腫脹，具有一定的抗炎消腫作用[6]。相比抗生素，中藥具有無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，在畜牧養(yǎng)殖中的作用日趨重要[7]?！吨袊?guó)獸藥典》2015版第2部中規(guī)定沒食子酸為地榆的主要成分[8]，文獻(xiàn)報(bào)道多采用酸水煎煮或回流提取植物中的沒食子酸[9-11]，而關(guān)于地榆沒食子酸的提取和生產(chǎn)報(bào)道較少，僅藍(lán)海等[12]采用醇提取紫蘇地榆沒食子酸。因此，為拓展地榆沒食子酸的提取方法，筆者等運(yùn)用Plackett-Burnman(PBD)設(shè)計(jì)和Box-Behnken-響應(yīng)面法(BBD)，優(yōu)化建立安全、穩(wěn)定的地榆沒食子酸的提取工藝，以期為該中藥的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品及試劑 地榆分析樣品，購(gòu)自四川千方中藥飲片有限公司，批號(hào)20110301，產(chǎn)地四川；沒食子酸對(duì)照品，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110765-201308；其他試劑為色譜純或分析純。

1.1.2 儀器 LC-20型島津高效液相色譜儀，日本島津公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，成都美普達(dá)儀器有限公司；BSA224S型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；潔拓超聲波清洗儀，深圳市潔拓超聲清洗設(shè)備有限公司；DHG-9240A電熱恒溫干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；RE-5205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；多功能提取罐，成都永泰化工機(jī)械廠；真空濃縮回收器，成都永泰化工機(jī)械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸的定量檢測(cè)[8]

1) 色譜條件。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.05%磷酸溶液(5∶95)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為272 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2) 對(duì)照品溶液的制備。取沒食子酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL含 30 μg的溶液。

3) 供試品溶液的制備。取藥材粉末(過四號(hào)篩)約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加10%鹽酸溶液10 mL，加熱回流3 h，放冷，過濾，濾液置于100 mL量瓶中，用水適量分?jǐn)?shù)次洗滌容器和殘?jiān)?，洗液濾入同一量瓶中，加水至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得，記錄對(duì)照品和樣品的色譜圖。

4) 線性關(guān)系考察。精密稱取沒食子酸對(duì)照品12.03 mg置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別吸取對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、12 mL、17 mL于50 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，所得對(duì)照品濃度分別為4.82 μg/mL、9.64 μg/mL、19.28 μg/mL、38.56 μg/mL、57.84 μg/mL、81.94 μg/mL，分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖峰面積。以峰面積值Y對(duì)對(duì)照品濃度X進(jìn)行回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

5) 精密度試驗(yàn)。精密吸取沒食子酸對(duì)照品溶液(19.28 μg/mL)10 μL，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

6) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取地榆藥材，制備供試品溶液。取供試品溶液，于制備后0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算峰面積的RSD。

7) 重現(xiàn)性試驗(yàn)。取地榆藥材6份，制備樣品供試品溶液，取供試品溶液進(jìn)樣10 μL，計(jì)算沒食子酸含量。

8) 加樣回收試驗(yàn)。取已知含量(3.14 mg/g)的樣品0.5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入沒食子酸對(duì)照品溶液(0.24 mg/mL)5 mL，制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定，以供試品溶液中絕對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算加樣回收率。

1.3 PBD篩選主要因素

取10 g地榆采用水浴加熱進(jìn)行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.35～1.40(70℃)的浸膏。運(yùn)用Designexpert 10.3.2進(jìn)行PBD試驗(yàn)，考察各個(gè)因素對(duì)出膏率和沒食子酸提取量的影響。根據(jù)中藥材中試提取經(jīng)驗(yàn)，試驗(yàn)對(duì)A(浸泡時(shí)間)、B(乙醇體積分?jǐn)?shù))、C(溶劑量)、D(溫度)、E(提取時(shí)間)、F(提取次數(shù))等6個(gè)主要因素進(jìn)行評(píng)價(jià)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果確定每個(gè)因素高(代碼：1)、低(代碼：-1)2個(gè)水平共12組試驗(yàn)，篩選對(duì)出膏率和沒食子酸提取量的主要影響因子。PBD試驗(yàn)因素和水平見表1。

1.4 BBD 試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

取10 g地榆采用水浴加熱進(jìn)行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.35～1.40(70℃)的浸膏。根據(jù)PBD試驗(yàn)結(jié)果，以出膏率(y1)和沒食子酸含量(y2)為目標(biāo)響應(yīng)值，選取提取次數(shù)(x1)、提取時(shí)間(x2)和溶劑量(x3)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)因素水平見表2。采用多指標(biāo)數(shù)據(jù)處理“歸一值(OD)”[13]對(duì)出膏率和沒食子酸含量進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，OD=(d1d2d3……dn)1/n，n為指數(shù)，取值越小越好的指標(biāo)di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，取值越大越好的指標(biāo)di=(yi-ymin)/(ymax-ymin)，i=1，2，3……n，n 為指標(biāo)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸定量檢測(cè)試驗(yàn)的可靠性

線性關(guān)系試驗(yàn)得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y= 255 79x-19 089，R2= 0.999 2，進(jìn)樣濃度在4.82～81.94 μg/mL，表明進(jìn)樣濃度和峰面積線性關(guān)系良好。沒食子酸對(duì)照樣品和檢測(cè)樣品的HPLC色譜圖見圖1。精密度試驗(yàn)得出對(duì)照樣品RSD<2%，說明儀器精密性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，沒食子酸色譜峰面積RSD值為1.03%，樣品供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。重現(xiàn)性試驗(yàn)得出，地榆樣品平均含量為1.52 mg/g，RSD<2%，表明該樣品處理方法重現(xiàn)性好。加樣回收試驗(yàn)表明，沒食子酸平均回收率為99.81%，RSD為0.61%，說明方法可靠，準(zhǔn)確度好，符合含量測(cè)定的要求。

2.2 影響地榆提取工藝的主要因素

按照PBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到各處理的出膏率和沒食子酸提取量(表3)。顯著性分析結(jié)果(表4)表明，溶劑量、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)沒食子酸提取量的影響達(dá)顯著水平，浸泡時(shí)間、溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響不顯著；6個(gè)試驗(yàn)因子中除提取次數(shù)外其余因子對(duì)出膏率的影響程度均不顯著。因此，溶劑量、提取次數(shù)、提取時(shí)間是沒食子酸提取量和出膏率的主要影響因子，故以溶劑量、提取次數(shù)和提取時(shí)間進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

表3 PBD試驗(yàn)不同因子與水平下地榆的出膏率和沒食子酸提取量

表4 PBD試驗(yàn)各因素對(duì)出膏率和沒食子酸提取量的影響顯著性(P值)

注：* *和*分別表示影響程度達(dá)極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)水平。

Note:* *and*indicate significant difference at 1% and 5% levels respectively.

2.3 提取工藝回歸模型的建立

根據(jù)BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到溶劑量、提取次數(shù)、提取時(shí)間不同水平條件的出膏率、沒食子酸提取量和OD值(表5)。以O(shè)D值為響應(yīng)值分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，得到OD值對(duì)提取次數(shù)x1、提取時(shí)間x2和溶劑量x3的二次多項(xiàng)回歸方程：OD=-5.21+1.54x1+1.08x2+0.11x3+0.01x1x2+0.02x1x3+0.01x2x3-0.46x12-0.08x22-0.01x32。模型F=24.16，P<0.001，響應(yīng)回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，失擬不顯著，說明該回歸模型擬合程度較好[14]。

2.4 地榆沒食子酸最佳提取工藝的建立

以x1、x2、x3中任意一個(gè)變量固定，其余2個(gè)變量對(duì)OD值作響應(yīng)面圖。從圖2看出，x2和x3對(duì)OD值的交互作用不顯著，x1和x2對(duì)OD值有一定影響，x1和x3對(duì)OD值的交互作用明顯[15]。根據(jù)回歸模型，得到地榆的最佳提取工藝為：加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h，預(yù)測(cè)值y1=16.24%，y2=4.25 mg/g。

表5 BBD試驗(yàn)不同處理的出膏率和沒食子酸提取量

2.5 最佳提取工藝的驗(yàn)證

取地榆根適量，加33.5倍水， 90℃下回流提取4.2 h，提取2次，按此工藝參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到平均出膏率為16.27%，沒食子酸平均提取量為4.21 mg/g(表6)。沒食子酸提取量和出膏率與預(yù)測(cè)值相近，說明建立的回歸模型較好，獲得的地榆沒食子酸提取最佳工藝具有良好的可信度。

2.6 最佳工藝在生產(chǎn)試驗(yàn)中的應(yīng)用效果

分別采用原工藝和最佳工藝對(duì)5組地榆商品進(jìn)行擴(kuò)大化生產(chǎn)試驗(yàn)(20140621、20140526原工藝，20151101、20151102和20151103最佳工藝)，生產(chǎn)試驗(yàn)每組地榆按50 kg進(jìn)行擴(kuò)大，配套相應(yīng)工藝參數(shù)，采用多功能提取罐進(jìn)行提取、真空濃縮回收器濃縮，得到擴(kuò)大生產(chǎn)后的2種工藝條件下沒食子酸轉(zhuǎn)移率和出膏率(表7)。相比于原工藝，最佳工藝的出膏率提高51.0%，沒食子酸轉(zhuǎn)移率提高105.8%，均有顯著提高。因此，最佳工藝可以應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

表6 地榆沒食子酸最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

表7 地榆沒食子酸最佳提取工藝在生產(chǎn)試驗(yàn)中的出膏率和沒食子酸提取量

3 結(jié)論與討論

通過Plackett-Burnman設(shè)計(jì)和Box-Behnken-響應(yīng)面法優(yōu)化地榆沒食子酸的提取工藝，得到地榆沒食子酸的最佳提取工藝為加33.5倍水，90℃下回流提取2次，每次4.2 h。與原工藝提取比較，應(yīng)用該工藝對(duì)地榆進(jìn)行提取，其出膏率提高51.0%，沒食子酸轉(zhuǎn)移率提高105.8%，提取效果好。

在中藥有效成分提取中需考慮到多個(gè)單因素試驗(yàn)以及試驗(yàn)次數(shù)較多的正交設(shè)計(jì)，工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力且具有盲目性，因此，本試驗(yàn)引用全新設(shè)計(jì)，為提取工藝的研究與提取率的提高提供新的思路和方法。PBD是一種近飽和的兩水平篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過比較各因子兩水平的差異與整體的差異來確定因子的顯著性，能用最少的試驗(yàn)次數(shù)快速有效地篩選出顯著影響因子[16]。BBD-響應(yīng)面法具有結(jié)果直觀、預(yù)測(cè)性好的優(yōu)點(diǎn)，試驗(yàn)預(yù)測(cè)值能更好的考察參數(shù)合理性和試驗(yàn)設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確性[17]。本研究通過驗(yàn)證試驗(yàn)，其驗(yàn)證結(jié)果大于預(yù)測(cè)值，說明PBD聯(lián)合BBD-響應(yīng)面法在中藥提取中具有良好的可行性。

PBD試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高濃度乙醇不利于沒食子酸的提取，與藍(lán)海等[12]用醇提沒食子酸的最佳工藝相悖，劉麗艷[18]用酸或堿水解得到鞣質(zhì)，通過乙酸乙酯萃取得到?jīng)]食子酸的粗提液，但在工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)成本高昂，不可能采用醇、酸或堿提取。藥材在生產(chǎn)試驗(yàn)提取過程中，干膏率和沒食子酸提取量均有所下降，所以在提取過程中應(yīng)盡量將藥材分裝到較大的袋中，增大藥材與水的接觸面積，減少藥渣與水混合，同時(shí)避免粉碎后投料易堵塞過濾網(wǎng)而造成過濾困難。由于工藝采用水提取，試驗(yàn)中得出高溫有利于沒食子酸提取，但并未對(duì)提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，后續(xù)試驗(yàn)應(yīng)該對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行更加細(xì)化。