3,5-二硝基水楊酸法測定黃水中總糖的含量

宋嬌嬌，裴 斐，馬 勇，朱 青，趙 祥

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800）

黃水是濃香型白酒主要的副產(chǎn)物，黃水中含有豐富的酸類、酯類、醇類等呈香呈味物質(zhì)[1]，同時(shí)含有大量的糖和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，限制了黃水的應(yīng)用[2]，通常將黃水經(jīng)預(yù)處理后再利用，總糖含量是評價(jià)處理效果的標(biāo)準(zhǔn)之一。實(shí)驗(yàn)室常用的總糖檢測方法是滴定法與比色法，滴定法對溶液中的總糖含量、滴定速度、滴定環(huán)境等都有要求，且個(gè)人操作上的習(xí)慣、熟練程度等都會(huì)對結(jié)果造成較大的影響[3]。黃水顏色一般為亮黃色、深黃色甚至黑色，也會(huì)干擾對滴定終點(diǎn)的判定。比色法常用的有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水楊酸法，但前兩種方法用的硫酸腐蝕性較強(qiáng)，會(huì)造成一定的安全隱患[4]。3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）是半微量定糖法，該方法操作簡單、便捷，雜質(zhì)干擾較少，便于批量測定，是一種常用的測糖方法[5]。該方法的原理是在堿性條件下還原糖將3,5-二硝基水楊酸中的硝基還原成氨基，生成橘紅色化合物，在一定的范圍內(nèi)，還原糖含量與顏色成正比[6]。本試驗(yàn)采用鹽酸將黃水中的總糖水解成還原糖，利用DNS法在最適波長下進(jìn)行檢測，利用吸光值與還原糖之間的線性關(guān)系計(jì)算黃水中總糖含量[7]。本研究考察顯色劑添加量、顯色時(shí)間、顯色溫度對檢測結(jié)果的影響，采用正交試驗(yàn)確定黃水總糖水解條件，并進(jìn)行方法學(xué)考察，建立3,5-二硝基水楊酸測定黃水中總糖含量的方法，以期為黃水的預(yù)處理等應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃水，取自洋河酒廠濃香車間。

重蒸酚，上海一基實(shí)業(yè)有限公司；葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、鹽酸、氫氧化鈉、無水亞硫酸鈉均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海左樂儀器有限公司；純水機(jī)，上海摩勒科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋，常州市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠；UV-6000PC型紫外/可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑的配制

DNS試劑的配制[8]：稱取6.3 g 3,5-二硝基水楊酸溶于262 mL 2 mol/L的氫氧化鈉溶液中。將此溶液與500 mL含182 g酒石酸鉀鈉的熱水混合，再添加5 g重蒸酚和5 g亞硫酸鈉，攪拌溶解后定容至1000 mL，充分混勻，存于棕色瓶中，避光存放7 d后使用。

1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取已烘干的葡萄糖1 g，加純水定容至1 L，充分搖勻備用。

1.2.2 檢測條件優(yōu)化[9]

（1）顯色劑添加量對檢測結(jié)果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加顯色劑0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL、5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL，100℃水浴中顯色反應(yīng)10 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

（2）顯色時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加顯色劑5 mL，100℃水浴中分別選擇顯色反應(yīng)時(shí)間1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min、19 min、21 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

（3）顯色溫度對檢測結(jié)果的影響

取1 mL 1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加顯色劑5 mL，分別在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴中顯色反應(yīng)7 min，自來水迅速冷卻，純水定容至25 mL，以空白為對照，在波長540 nm處檢測吸光值。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支25 mL比色管，分別添加0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL的1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再添加純水使總體積到1 mL，然后添加5.0 mL的DNS試劑，充分混合后在90℃中水浴7 min，取出后用自來水迅速冷卻，加純水至25 mL充分搖勻后靜置。以不加葡萄糖反應(yīng)液為對照，在540 nm處測定吸光值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 黃水水解條件的優(yōu)化

只有黃水中總糖充分水解，總糖含量檢測結(jié)果才準(zhǔn)確，影響黃水水解的主要條件有水解時(shí)間、鹽酸濃度、鹽酸添加量。本試驗(yàn)參考液態(tài)發(fā)酵成熟醪總糖水解方法[10]，選擇水解溫度100℃，以水解時(shí)間、鹽酸濃度、鹽酸添加量為變量，以吸光值為指標(biāo)，采用3因素3水平，按L9（33）正交試驗(yàn)進(jìn)行黃水水解條件的優(yōu)化[11]，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

1.2.5 樣品測定

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表

取1 mL黃水水解液于25 mL容量瓶中，其他步驟同1.2.4，測定樣品的吸光值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃水總糖含量。

黃水濃度(mg/mL)=樣品濃度×稀釋倍數(shù)。

1.2.6 方法學(xué)考查

（1）精密度試驗(yàn)

取同一組黃水按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下連續(xù)測定6次吸光值?？疾榉椒ǖ木芏?。

（2）重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批黃水6份，按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下測定吸光值?？疾榉椒ǖ闹貜?fù)性。

（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照1.2.3與1.2.5確定的檢測條件和水解條件，在540 nm波長下測定吸光值，在顯色反應(yīng)結(jié)束90 min內(nèi)，每隔10 min測定1次?？疾榉椒ǖ姆€(wěn)定性。

（4）回收率試驗(yàn)

取同一黃水水解液，加入不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照樣品檢測方法對回收率進(jìn)行考查。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

2.1.1 顯色劑添加量對檢測結(jié)果的影響（圖1）

圖1 顯色劑添加量對檢測結(jié)果的影響

由圖1可知，當(dāng)顯色劑添加量小于5 mL時(shí)，溶液吸光值隨著顯色劑添加量的增加而增大；當(dāng)顯色劑添加量大于5 mL時(shí)，溶液的吸光值基本無變化?？紤]到節(jié)約資源，顯色劑的最佳添加量為5 mL。

2.1.2 顯色時(shí)間對檢測結(jié)果的影響（圖2）

由圖2可知，隨著顯色時(shí)間的延長，吸光值呈現(xiàn)先增加后下降并趨于穩(wěn)定的趨勢，顯色時(shí)間為7 min時(shí)，吸光值為最大值，因此選擇顯色時(shí)間7 min。

2.1.3 顯色溫度對檢測結(jié)果的影響（圖3）

由圖3可知，顯色溫度對檢測結(jié)果影響較大，當(dāng)顯色溫度達(dá)到90℃后，吸光值趨于穩(wěn)定，因此選擇最佳顯色溫度為90℃。

圖2 顯色時(shí)間對檢測結(jié)果的影響

圖3 顯色溫度對檢測結(jié)果的影響

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制（圖4）

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.6987x-0.0245，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9956，表明葡萄糖溶液在0～1.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 黃水水解條件的優(yōu)化

采用3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對黃水總糖水解條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2中的極差分析可知，RA＞RC＞RB，3個(gè)因素對黃水水解液吸光值的影響順序依次為：水解時(shí)間（A）＞鹽酸添加量（C）＞鹽酸濃度（B）。由表3方差分析結(jié)果可知，水解時(shí)間對黃水水解液的吸光值影響顯著（P＜0.05），其他因素對結(jié)果無顯著性影響（P＞0.05）。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析，水解最佳條件為A2B3C3，即水解時(shí)間30 min，鹽酸濃度12 mol/L，鹽酸添加量15 mL。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

2.4 方法學(xué)考查

2.4.1 精密度試驗(yàn)（表4）

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為0.82%＜2%，說明3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)（表5）

由表5可知，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.62%＜2%，說明3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)（表6）

表5 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，黃水總糖在0～90 min內(nèi)吸光值基本穩(wěn)定不變，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.62%＜2%，說明采用3,5-二硝基水楊酸法測定黃水總糖在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 回收率試驗(yàn)（表7）

由表7可知，黃水中添加葡萄糖標(biāo)液檢測回收率在94.60%～97.60%，RSD值均小于2%，證明該方法對總糖的回收性良好，該方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

本研究對3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）測定黃水中總糖的檢測條件和水解條件進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行了方法學(xué)考查，建立了DNS法測定黃水中總糖含量的方法。確定了3,5-二硝基水楊酸法檢測黃水中總糖的檢測條件為：顯色劑添加量5 mL，顯色時(shí)間7 min，顯色溫度90℃；黃水總糖水解條件為：水解時(shí)間30 min，鹽酸濃度12 mol/L，鹽酸添加量15 mL。該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%），平均加標(biāo)回收率94.60%～97.60%，RSD值均小于2%。表明該方法檢測黃水中總糖準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性好。該方法適用于黃水中總糖檢測，可為黃水應(yīng)用提供依據(jù)，也可為其他總糖的測定提供參考。

表7 回收率試驗(yàn)結(jié)果