芝麻香型白酒對(duì)小鼠飲酒行為情緒及多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響

趙德義 ，皇甫潔 ，曹建全 ，孫 偉 ，韓興林 ，王德良

（1.山東景芝酒業(yè)股份有限公司，山東濰坊262119； 2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015；3.科技部國(guó)家酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京100015）

我國(guó)白酒釀造具有悠久歷史，在工藝上與西方蒸餾酒釀造存在顯著不同。我國(guó)白酒由于采用多維微生物發(fā)酵等傳統(tǒng)釀造工藝，酒體和諧豐滿，風(fēng)格獨(dú)特。與世界上其他蒸餾酒相比，中國(guó)白酒是微量風(fēng)味組分和生物活性成分最為豐富的蒸餾酒。同時(shí)，中國(guó)白酒香型眾多，不同工藝生產(chǎn)的白酒，微量風(fēng)味組分的含量及比例差異顯著。目前國(guó)內(nèi)在研究白酒健康課題時(shí)側(cè)重于白酒中單體微量成分，如核苷、四甲基吡嗪、萜烯類等成分。但由于這些成分在酒體中含量較低、研究結(jié)果不能準(zhǔn)確描述和定量出在以大量酒精為載體溶劑的條件下，這些成分在人體生理代謝中明確的作用。消費(fèi)者在飲用不同香型或工藝白酒時(shí)，普遍反映不同工藝白酒在人體中的積累和代謝速度顯著不同，分析認(rèn)為這可能與其微量成分相關(guān)，微量成分比例及種類顯著影響酒精在人體內(nèi)生理代謝的程度。因此，認(rèn)為不同工藝釀造的白酒，由于其酒體成分含量及比例的差異性，消費(fèi)者飲酒后的行為情緒感受也有一定差異性。有些白酒造成的不適感相對(duì)較少，放松愉悅感相對(duì)較明顯，有些造成的不適感相對(duì)較明顯，放松愉悅感相對(duì)較小。

消費(fèi)者飲酒后有不同的感受，包括喜悅、高興、緊張、舒緩放松、壓抑等等。從生物化學(xué)角度來(lái)說(shuō)，這些感受是由神經(jīng)和分子變化機(jī)制所調(diào)控的。飲酒后體內(nèi)的酒精及酒體中其他微量成分直接保留或間接轉(zhuǎn)化的小分子代謝物作用于神經(jīng)元細(xì)胞上的受體蛋白，調(diào)控其翻譯過(guò)程，進(jìn)而增強(qiáng)樹突鈣離子信號(hào)發(fā)揮調(diào)控作用。飲酒后心情愉悅，自信和健談，鎮(zhèn)靜舒緩都與酒和某些酒體成分進(jìn)入大腦后對(duì)獎(jiǎng)賞中心的信號(hào)激活有關(guān)。多年研究已經(jīng)證明[1，3]，能夠參與信號(hào)激活的體內(nèi)小分子代謝物質(zhì)包括乙醇、乙醛、乙酸、多巴胺、5-羥色胺、5-羥吲哚乙酸、γ-氨基丁酸、腎上腺素等。其中，乙醇、乙醛、乙酸與酒體代謝轉(zhuǎn)化快慢有關(guān)，5-羥色胺、γ-氨基丁酸、多巴胺、腎上腺素是神經(jīng)遞質(zhì)，通過(guò)改變其表達(dá)水平，影響大腦中的其他化學(xué)分子表達(dá)，作為化學(xué)信使向全身傳遞信號(hào)，控制人的思維過(guò)程、行為和情緒。

本實(shí)驗(yàn)選定了芝麻香型白酒一品景芝芝香白酒與其他類型的白酒，通過(guò)比較分析小鼠灌胃不同白酒30 min和2 h后在固定時(shí)間運(yùn)動(dòng)的行為參數(shù)比，以及小鼠大腦皮層、海馬中多巴胺表達(dá)水平，基于此從行為整體和分子層面評(píng)價(jià)以一品景芝芝香白酒為代表的芝麻香型白酒飲用后帶來(lái)的飲后行為情緒差異。

1 材料與方法

1.1 材料

酒樣：來(lái)自山東景芝酒業(yè)股份有限公司提供的及市售的幾款不同品牌芝麻香型及其他類型白酒，分別是：一品景芝芝香白酒（53%vol），一品景芝芝香白酒（42%vol），某芝麻香型酒A（53%vol）、某芝麻香型酒B（42%vol），某醬香型代表酒（53%vol）、某濃香型代表酒（52%vol），伏特加（96%vol）作為食用酒精對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：C57小鼠，雄性，清潔Ⅱ級(jí)，4～6周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。隨機(jī)選取小鼠80只，平均體重為23 g±2 g，于室溫23℃±2℃，光照（150 lx）12 h和黑暗12 h環(huán)境，自由飲水進(jìn)食飼喂，1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前提前1天將小鼠置于曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室以適應(yīng)環(huán)境。

1.2 儀器與設(shè)備

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)跟蹤系統(tǒng)：ANY-Maze系統(tǒng)（美國(guó)Stoelting公司），該儀器主要由一個(gè)半徑為20 cm的白底箱壁透明半封閉有機(jī)玻璃圓筒組成，其頂部中央懸掛有攝像機(jī)，并與記錄系統(tǒng)相連，以此來(lái)跟蹤小鼠在曠場(chǎng)中的行為，其數(shù)據(jù)由ANYMaze軟件進(jìn)行記錄并分析。

柏恩特超純水制備儀。Multiskan FC酶標(biāo)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠灌胃

實(shí)驗(yàn)時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組1（96%vol食用酒精）和對(duì)照組2（生理鹽水），每組10只。根據(jù)《中國(guó)居民膳食指南（2016）》規(guī)定：成人飲酒，男性酒精量≤25 g/d，女性≤15 g/d。因此，每只小鼠灌酒酒量按照人體標(biāo)準(zhǔn)飲酒量并依據(jù)小鼠單位體重與人體單位體重的藥劑等效劑量比值（9.1倍）進(jìn)行折算。每只小鼠（平均體重20.3 g）灌酒樣酒量（將所有酒樣統(tǒng)一用蒸餾水稀釋至42%vol）為0.15 mL/只；相當(dāng)于成年男性（平均70 kg）攝入酒精量20.04 g/人。

1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

在灌胃完成后，計(jì)錄時(shí)間。在灌酒后30 min和120 min后，依次按照分組將每只小鼠放置于曠場(chǎng)底面中央。利用高頻攝像機(jī)及軟件跟蹤記錄動(dòng)物在曠場(chǎng)內(nèi)自由運(yùn)動(dòng)60 s內(nèi)的行為變化，采集的數(shù)據(jù)主要為移動(dòng)距離。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持安靜，動(dòng)作輕柔；每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，及時(shí)清除糞便，使用72%乙醇溶液清潔底面并擦干，減少之前動(dòng)物的氣味，防止行為干擾。

1.3.3 小鼠腦組織樣本多巴胺（DA）濃度測(cè)定

給小鼠灌胃酒后，分別在30 min和2 h后直接處死小鼠，取材腦組織（大腦皮層、海馬體等），液氮保藏后，放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。將組織標(biāo)本切割，稱取重量，加入一定量的PBS（pH7.4）。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度。加入一定量的PBS（pH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20 min左右（2000～3000 r/min）。仔細(xì)收集上清液。分裝后取一份待檢，其余冷凍備用。小鼠腦區(qū)多巴胺分析采用上海mibio酶聯(lián)生物公司的小鼠多巴胺（DA）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒。

1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS Statistics 24軟件，使用單因素ANOVA方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用Tableau作圖，數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示；同時(shí)，使用數(shù)值變量對(duì)應(yīng)分析方法和因子分析方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 飲酒后小鼠曠場(chǎng)行為參數(shù)差異分析

動(dòng)物精細(xì)行為學(xué)是試驗(yàn)動(dòng)物在精確控制前提下模型解析人在外界環(huán)境及刺激下的行為及產(chǎn)生原因的試驗(yàn)系統(tǒng)。在很多場(chǎng)景下不但能模擬人情緒、運(yùn)動(dòng)、活動(dòng)等各方面特點(diǎn)，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高的重復(fù)性，是目前國(guó)際上通行的試驗(yàn)方法。在神經(jīng)精神藥物的評(píng)價(jià)方面，利用動(dòng)物行為學(xué)方法在神經(jīng)生物學(xué)新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病新動(dòng)物模型的建立、神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)、藥物或環(huán)境化合物新神經(jīng)毒性作用及發(fā)生新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)等領(lǐng)域得到廣泛認(rèn)可。

本實(shí)驗(yàn)將灌胃不同酒樣的每組小鼠依次在灌酒前（t0），灌酒后 30 min（t1）和灌酒后 120 min（t2）這3個(gè)時(shí)刻置于動(dòng)物精細(xì)行為學(xué)分析裝置曠場(chǎng)中（直徑100 cm的白底透明壁的圓柱形設(shè)備）中，采用高頻攝像機(jī)和行為學(xué)分析軟件分別實(shí)時(shí)錄制與同步分析小鼠在上述3個(gè)時(shí)刻小鼠自由運(yùn)動(dòng)1 min的行為軌跡；通過(guò)行為參數(shù)自動(dòng)分析，根據(jù)獲得的灌酒前和灌酒后的行為學(xué)參數(shù)，通過(guò)灌酒后行為參數(shù)（t1，t2）灌酒前行為參數(shù)（t0），分析計(jì)算得到行為參數(shù)比，用于評(píng)價(jià)和判定小鼠行為受到酒樣代謝影響后表現(xiàn)程度，通過(guò)分析參數(shù)比剔除了組內(nèi)小鼠生物個(gè)體差異影響的偏差。結(jié)果見表1。

表1 灌酒后(t1：30 min,t2：120 min)每組小鼠行為參數(shù)比(移動(dòng)距離比)

表1表明：不同白酒的工藝類型、風(fēng)味微量成分的相互整體作用對(duì)酒的飲后行為差異有一定影響。以移動(dòng)時(shí)間比進(jìn)行說(shuō)明，在適量飲酒范圍內(nèi)，飲酒后半小時(shí)，即使所有的實(shí)驗(yàn)酒樣都稀釋至相同酒精度，但是高酒精度的酒（53%vol）小鼠行為表現(xiàn)興奮，移動(dòng)距離比大于1，低酒精度的酒（42%vol）行為表現(xiàn)抑制，移動(dòng)距離比小于1。這可能與酒體中微量成分的作用有關(guān)，高度酒微量成分種類豐富，比例協(xié)調(diào)，香氣口感豐富。在稀釋成42%vol后，其微量成分種類和比例雖然也有相應(yīng)程度上的稀釋，但是仍對(duì)酒體的整體風(fēng)格有一定程度影響。53%vol一品景芝芝香白酒與某醬香型代表酒和某濃香型代表酒相比，差異不顯著。這兩種對(duì)照酒樣無(wú)論是從口味、飲用舒適度和品牌上，長(zhǎng)期以來(lái)都得到消費(fèi)者廣泛的認(rèn)可。

根據(jù)多年來(lái)市場(chǎng)調(diào)研數(shù)據(jù)，多數(shù)飲酒環(huán)境一般為商業(yè)應(yīng)酬和親朋聚會(huì)，消費(fèi)者關(guān)注的飲酒感受重點(diǎn)在飲酒后30 min內(nèi)和2 h后，希望飲用后30 min內(nèi)個(gè)人的行為情緒最好能不受酒精的影響，或是感覺適量興奮或適量放松，有愉悅的感覺，而在飲酒后2 h能夠快速恢復(fù)到正常，不影響隨后的工作和生活?；谇捌诖罅繑?shù)據(jù)積累分析，我們把小鼠酒后行為參數(shù)比值范圍及人飲酒后感受特征范圍進(jìn)行對(duì)比（見表2）。當(dāng)小鼠飲酒后與飲酒前的比值暨行為參數(shù)比值為1，小鼠飲酒后行為恢復(fù)正常，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為與飲酒前感受相同。當(dāng)行為參數(shù)比值范圍區(qū)間為1～1.5時(shí)，小鼠表現(xiàn)適量興奮，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為精神振奮、愉悅高興、有活力壯膽；當(dāng)行為參數(shù)比值范圍區(qū)間為0.5～1時(shí)，小鼠表現(xiàn)為適量抑制，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為放松舒緩；當(dāng)行為參數(shù)比值范圍區(qū)間為1.6～2時(shí)，小鼠行為表現(xiàn)為過(guò)度興奮，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為亢奮、反應(yīng)過(guò)度、行為不受控制；當(dāng)行為參數(shù)比值范圍區(qū)間為0.2～0.5時(shí)，小鼠行為表現(xiàn)為過(guò)度抑制，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為麻痹，幾乎沒(méi)有反應(yīng)，行為不受控制；當(dāng)行為參數(shù)比值范圍區(qū)間為＞2或＜0.2時(shí)，小鼠行為表現(xiàn)為失去意識(shí)，對(duì)應(yīng)人飲酒表現(xiàn)為失去意識(shí)。結(jié)果分析表明，53%vol一品景芝芝香白酒飲后30 min，小鼠行為參數(shù)比范圍在1～1.5之間，表現(xiàn)為適量興奮，對(duì)應(yīng)的人的感受是精神振奮、愉悅高興。42%vol一品景芝芝香白酒飲后30 min，小鼠行為參數(shù)比范圍在0.5～1之間，表現(xiàn)為適量抑制，對(duì)應(yīng)的人的感受是放松、舒緩。飲酒后2 h，53%vol一品景芝芝香和42%vol一品景芝芝香，小鼠行為參數(shù)比范圍在0.5～1之間，表現(xiàn)為適量抑制，對(duì)應(yīng)的人的感受是放松、舒緩。

若飲酒后和飲酒前行為參數(shù)比為1，我們認(rèn)為酒對(duì)行為情緒的影響幾乎沒(méi)有，小鼠行為酒后恢復(fù)正常，與飲酒前感受相同，我們把此時(shí)酒體行為感受定為標(biāo)準(zhǔn)。為充分比較酒樣對(duì)行為情緒影響的差異，我們提出了“行為偏離度”這一概念，指飲酒后的行為參數(shù)比與1的差值的絕對(duì)值。行為偏離度越大，酒樣影響效果越大。飲酒后30 min，相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，與一品景芝芝香白酒相比，行為偏離度較大，分別表現(xiàn)為小鼠行為過(guò)度興奮亢奮，對(duì)應(yīng)人的感受是反應(yīng)過(guò)度行為，不受控制以及小鼠行為表現(xiàn)過(guò)度抑制麻痹，對(duì)應(yīng)人感受幾乎沒(méi)有反應(yīng)行為不控制。飲酒后120 min，雖然小鼠行為表現(xiàn)處于適量興奮或適量抑制范圍，但是相同酒精度的某芝麻香型白酒53%vol和42%vol，與一品景芝芝香白酒相比，行為偏離度仍然較大，飲后行為不易恢復(fù)。與某醬香型代表酒和某濃香型代表酒相比，行為偏離度差異不顯著。

根據(jù)以上結(jié)果推斷，一品景芝芝香白酒酒體中微量成分整體作用會(huì)對(duì)酒精代謝和飲酒后行為情緒產(chǎn)生一定影響，一品景芝芝香白酒飲用后更易有適量興奮及適量放松的愉悅感受，更易恢復(fù)正常，且酒精的致醉程度較小。

表2 小鼠灌胃后行為參數(shù)比值范圍及人飲酒后感受特征范圍

2.2 飲酒后小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺（DA）表達(dá)水平差異分析

多巴胺（C6H3(OH)2-CH2-CH2-NH2），化學(xué)名稱為4-（2-乙胺基）苯-1,2-二醇，簡(jiǎn)稱（DA），多巴胺是一種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)，由大腦回報(bào)和愉悅中心區(qū)域分泌，用來(lái)幫助細(xì)胞傳送脈沖的化學(xué)物質(zhì)，可影響一個(gè)人的情緒。2000年，確定多巴胺為腦內(nèi)信息傳遞者的研究人員Arvid Carlsson獲得了諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[1]。多巴胺是大腦的“獎(jiǎng)賞中心”，又稱多巴胺系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)大腦的情欲、感覺，將興奮及開心的信息傳遞，也與上癮有關(guān)。酒精進(jìn)入大腦后，在腦的獎(jiǎng)賞中心和協(xié)同、記憶部位的中心特定部位——伏隔核神經(jīng)元里發(fā)揮作用。酒精引發(fā)伏隔核釋放出大量的多巴胺，讓人們感覺心情愉快，變得自信和健談，對(duì)大腦具有鎮(zhèn)靜作用[2，4]。酒精在大腦中的神經(jīng)細(xì)胞之間通過(guò)受體信號(hào)傳導(dǎo)激活多巴胺表達(dá)[5]。德國(guó)埃爾朗根-紐倫堡大學(xué)（FAU）的科學(xué)家們對(duì)13000種食物成分進(jìn)行了研究，想要找出哪些成分能夠刺激大腦反應(yīng)中心，使人感覺良好，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大麥麥芽和啤酒中含有的大麥芽堿更刺激了多巴胺D2受體，促進(jìn)了多巴胺釋放程度，使人對(duì)事物的感覺更喜歡或是具有“上癮”的偏好性[7]。美國(guó)印第安納大學(xué)研究人員發(fā)現(xiàn)，啤酒的特殊口味可引發(fā)大腦中多巴胺的生成。具有酗酒家族史的人們具有更高的多巴胺指數(shù)。這項(xiàng)研究掃描了飲用啤酒和運(yùn)動(dòng)飲料佳得樂(lè)的49位男性測(cè)試者，每位男性測(cè)試者每15 min飲用15 mL啤酒，結(jié)果表明，飲用啤酒者比飲用佳得樂(lè)具有更顯著的多巴胺活躍性，同時(shí)，測(cè)試者在飲用少量啤酒之后表示更渴望飲用啤酒，但這種效應(yīng)不會(huì)出現(xiàn)于運(yùn)動(dòng)飲料，雖然運(yùn)動(dòng)飲料的口感更佳。這項(xiàng)研究首次令人信服地證實(shí)了啤酒口味可在大腦產(chǎn)生特殊刺激效果[8]。多巴胺表達(dá)水平在體內(nèi)處于一種平衡的狀態(tài)，微量增加引發(fā)愉悅自信舒緩喜好，含量降低過(guò)多引起運(yùn)動(dòng)遲緩、睡眠紊亂壓力，含量增加過(guò)多引起成癮嗜好[6]。

表3 小鼠大腦海馬體和皮層多巴胺含量

圖1 小鼠大腦海馬體（左）和大腦皮層（右）多巴胺含量

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠灌胃后30 min和120 min大腦皮層區(qū)和海馬區(qū)組織中的多巴胺（DA）表達(dá)水平，結(jié)果見表3和圖1。結(jié)果表明，不同香型白酒、同香型不同工藝白酒灌胃小鼠后，小鼠大腦皮層以及海馬體中多巴胺表達(dá)水平差異顯著（P＜0.05），多巴胺表達(dá)水平在飲用芝麻香型白酒后表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05），可能與芝麻香型白酒酒體中微量成分整體作用和酒精積累程度有關(guān)，多巴胺如果表達(dá)量增加在一定的適量范圍內(nèi)，可以增加愉悅的情緒感受及對(duì)芝麻香型白酒的喜好及認(rèn)可程度。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從行為整體和分子層面測(cè)定了小鼠灌胃以一品景芝芝香白酒為代表的芝麻香型白酒及其他類型白酒飲酒后30 min和120 min的曠場(chǎng)運(yùn)動(dòng)1 min內(nèi)的行為參數(shù)，以及在此時(shí)間點(diǎn)小鼠大腦皮層和海馬體中多巴胺表達(dá)水平，進(jìn)一步分析芝麻香型白酒飲后行為情緒及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)相同類型不同工藝的芝香型白酒，飲后行為情緒表現(xiàn)差異顯著，同時(shí)多巴胺在大腦中釋放程度差異顯著，推斷可能與白酒中類型和比例的微量成分協(xié)同作用相關(guān)。芝麻香型白酒相比其他香型白酒，可以引起愉悅放松感覺的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺在一定程度上適量積累表達(dá)，推斷可能與酒體中存在的能引起愉悅的風(fēng)味成分種類及比例相關(guān)。