慢性乙型肝炎肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞和IL-22的變化

陳敏，張宏宇，朱珉之，申紅玉，劉小琴，*

（常州市第三人民醫(yī)院，1.檢驗(yàn)科，2.肝病研究所，江蘇 常州213003）

我國是乙型肝炎病毒（HBV）感染大國，HBV感染是肝衰竭發(fā)生的主要原因之一。病理學(xué)檢查雖為診斷肝衰竭的金標(biāo)準(zhǔn)，但考慮到肝衰竭患者病情嚴(yán)重，常有凝血功能障礙，很難耐受肝臟穿刺等有創(chuàng)操作。目前臨床上，ALT、AST、總膽紅素和凝血酶原活性（prothrombin activity，PTA）可作為肝臟炎癥及損傷的評價(jià)指標(biāo)，但特異性均不強(qiáng)，在重癥患者中容易出現(xiàn)“膽酶分離”現(xiàn)象。終末期肝病模型（model for end-stage liver disease，MELD）各種評分系統(tǒng)被用于評估肝衰竭患者的病情嚴(yán)重程度和疾病預(yù)后，但計(jì)算較為繁瑣。因此，尋找新的標(biāo)志物用于肝衰竭患者的早期診斷及病情評估具有一定意義。

輔助性T細(xì)胞在慢性HBV感染所致的肝功能損傷及肝衰竭過程中發(fā)揮重要作用，我們的前期研究顯示，Th17細(xì)胞及相關(guān)因子參與慢性HBV感染進(jìn)程［1］。Th22細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的輔助性T細(xì)胞，多項(xiàng)研究［2-6］表明，Th22細(xì)胞及IL-22與多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，本研究主要觀察Th22細(xì)胞及其相關(guān)因子在HBV感染肝衰竭患者外周血中的變化，初步評價(jià)其在肝衰竭患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集我院2015年6月至2016年2月住院的慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者20例（CHB組），其中男14例，女6例，平均年齡（48.4±11.2）歲；HBV相關(guān)肝衰竭患者20例（肝衰竭組），其中男15例，女5例，平均年齡（50.2±12.5）歲。另以體檢健康者20例作為對照組，其中男15例，女5例，平均年齡（48.5±11.6）歲。CHB患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染學(xué)分會聯(lián)合修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［7］；HBV相關(guān)肝衰竭患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2012年中華醫(yī)學(xué)會感染學(xué)分會肝衰竭與人工肝學(xué)組和中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會重型肝病與人工肝學(xué)組聯(lián)合制定的《肝衰竭診治指南》［8］。所有病例入組前3個(gè)月，均未使用過免疫調(diào)節(jié)類藥物，無合并HCV、丁型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV感染和自身免疫性肝病，無原發(fā)性肝癌及肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤。所有患者在入院初采集血液標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測Th22細(xì)胞

采集肝素抗凝血5 mL，用淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），調(diào)整PBMC懸液細(xì)胞密度至5×106／mL，取100μL細(xì)胞懸液，加入等體積RPMI-1640稀釋，應(yīng)用佛波酯和離子霉素（美國eBioscience公司）聯(lián)合刺激后，加入1μL布雷菲德菌素A（BD公司），37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。取上述標(biāo)本，加入FITC標(biāo)記的CD4抗體（BD公司），充分混勻，4℃，避光30 min。加入100μL固定劑（BD公司）并孵育15 min；加入2 mL PBS，1 500 r／min離心5 min，傾去上清液，振蕩重懸細(xì)胞；加入100μL破膜劑（BD公司）和10μL IL-17AAPC抗體（eBioscience公司）、10μL IFN-γ-PE抗體（eBioscience公司）和20μL IL-22-PerCP抗體（eBioscience公司），振蕩混勻后孵育20 min；加入2 mL PBS洗滌，1 500 r／min離心5 min，去上清液；加入300μL PBS重懸細(xì)胞，應(yīng)用BD公司FACSC流式細(xì)胞儀進(jìn)行Th22細(xì)胞檢測。根據(jù)前向角FSC和側(cè)向角SSC參數(shù)圈定淋巴細(xì)胞，再用CD4-FITC和IFN-γ-PE分出P1群（IFN-γ-CD4+）細(xì)胞，再從P1群細(xì)胞中分離出Th22（IFN-γ-IL-17-IL-22+CD4+）細(xì)胞。

1.3 ELISA法檢測血漿IL-22濃度

應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法檢測血漿IL-22濃度（ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，將樣本的D值帶入方程式，計(jì)算出樣本濃度。具體操作按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.4 其他指標(biāo)檢測

ALT、總膽紅素、HBV-DNA均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展項(xiàng)目。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)K-S檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；連續(xù)變量相關(guān)性分析采用Pearson或Spearman相關(guān)分析；繪制受試者工作特征（receive operating characteristic，ROC）曲線并計(jì)算診斷敏感性和特異性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

3組性別和年齡間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；肝衰竭組HBV-DNA水平雖高于CHB組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；肝衰竭組和CHB組ALT和總膽紅素水平均明顯高于對照組（均P＜0.01）；肝衰竭組總膽紅素濃度顯著高于CHB組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 n＝20，±s

表1 各組一般資料及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較 n＝20，±s

a：P＜0.01，與對照組比較；b：P＜0.01，與CHB組比較

組別 男／女（例） 年齡（歲） HBV-DNA（lg拷貝／mL） ALT（U／L） 總膽紅素（μmol／L）肝衰竭組 15／5 50.2±12.5 5.26±1.34 210.40±144.60a 309.10±161.54a，b CHB組 14／6 48.4±11.2 5.03±1.22 180.65±124.69a 31.55±12.78a對照組 15／5 48.5±11.6 19.75±5.45 10.2±3.37檢驗(yàn)值 χ2＝0.17 F＝0.156 t＝0.554 F＝17.30 F＝63.51 P值0.918 0.856 0.582 0.000 0.000

2.2 3組患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，肝衰竭組Th22細(xì)胞頻數(shù)明顯高于CHB組及對照組（P ＝0.048，0.001）；CHB組Th22細(xì)胞頻數(shù)雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.193）。見表2、圖1。ELISA法檢測結(jié)果顯示，肝衰竭患者IL-22濃度顯著高于CHB組和對照組（P＝0.013，0.000）；CHB組IL-22濃度雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.075）。見表2。

表2 各組患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)及IL-22濃度比較n＝20

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)

2.3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞和IL-22濃度差異

將肝衰竭患者分為早期（30%＜PTA≤40%）、中期（20%＜PTA≤30%）和晚期（PTA≤20%）3組。早期和中期肝衰竭患者Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度雖高于晚期患者，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同分期肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)及IL-22濃度比較

2.4 外周血Th22細(xì)胞及IL-22預(yù)測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線分析

將肝衰竭組和CHB組患者Th22細(xì)胞頻數(shù)及IL-22濃度等數(shù)據(jù)繪制ROC曲線，見圖2。Th22細(xì)胞在CHB患者中預(yù)測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線下面積為0.655（95% CI：0.484～0.826），雖高于0.5，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.094）；IL-22預(yù)測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線下面積為0.753（95% CI：0.598～0.907），顯著高于0.5，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.006）。IL-22預(yù)測肝衰竭最佳臨界值為32.80 pg／mL，此時(shí)的敏感性為80.0%，特異性為65.0%，陽性預(yù)測值為69.57%，陰性預(yù)測值為76.47%，約登指數(shù)為0.725。

圖2 Th22細(xì)胞和IL-22預(yù)測肝衰竭發(fā)生的ROC曲線

2.5 肝衰竭患者Th22細(xì)胞及IL-22與肝功能、HBV病毒載量的關(guān)系

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)與IL-22濃度呈正相關(guān)（r＝0.766，P＜0.01）。Pearson或Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)、IL-22濃度與ALT表達(dá)水平不相關(guān)（均P＞0.05），與lg HBV-DNA水平也不相關(guān)（均P＞0.05），與總膽紅素濃度呈正相關(guān)（r＝0.420，0.476，均P＜0.05）。

3 討論

Th22細(xì)胞為新近發(fā)現(xiàn)的一種CD4+Th亞群，分泌IL-22和TNF-α，但不分泌IFN-γ和IL-17，具有表型CCR4+、CCR6+、CCR10+的特點(diǎn)，其關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子為芳香烴受體。IL-22主要來源于Th22細(xì)胞，Th1和Th17細(xì)胞也可少量分泌IL-22。IL-22受體包含一個(gè)IL-22R1鏈和一個(gè)IL-10R2鏈，IL-22結(jié)合的特異性依賴于IL-22R1，而IL-10R2則介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。IL-22R1表達(dá)于肝臟、皮膚、肺、腎臟、胰腺等組織，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞缺少IL-22R1的表達(dá)。因此，Th22作用特點(diǎn)有別于其他淋巴細(xì)胞，其作用對象非免疫細(xì)胞，而是肝臟、皮膚等表達(dá)IL-22R1的組織細(xì)胞［9］。

既往研究表明，Th22細(xì)胞在自身免疫性疾病及腫瘤中發(fā)揮重要作用［10-11］，表明Th22可能參與機(jī)體的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，而在CHB活動期常伴有免疫系統(tǒng)的激活和肝組織炎癥損傷。目前認(rèn)為，IL-22在HBV感染的肝臟疾病中是一把雙刃劍，既有促炎作用，也有保護(hù)肝臟作用，究竟發(fā)揮什么作用，可能依賴于肝臟特異性的微環(huán)境。在急性HBV感染時(shí)，IL-22可能發(fā)揮促炎作用，幫助機(jī)體清除HBV，但同時(shí)也會引起肝細(xì)胞損傷；在HBV慢性感染進(jìn)程中，IL-22可能發(fā)揮保護(hù)作用，即促進(jìn)肝細(xì)胞分化和生存來補(bǔ)償長期慢性炎癥引起的肝損傷［12］。

本研究結(jié)果顯示，CHB肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度高于健康對照組，與其他研究報(bào)道一致［4-6］，提示Th22細(xì)胞和IL-22可能在肝衰竭進(jìn)展中發(fā)揮一定作用。已有研究表明，IL-22通過活化下游通路信號分子及STAT3，在ConA誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中發(fā)揮保護(hù)作用［13］。慢性HBV感染進(jìn)程中，由炎癥細(xì)胞生成的IL-22可通過STAT3信號通路促進(jìn)肝祖細(xì)胞增殖［14］。Xing等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在GaIN／LPS誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠模型中，應(yīng)用rhIL-22治療后，小鼠ALT、總膽紅素降低，死亡率顯著下降；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)rhIL-22治療可增加肝臟還原型谷胱甘肽水平，降低丙二醛含量，降低血清TNF-α和肝臟Caspase-3的活性，rhIL-22可通過激活STAT3上調(diào)Bcl-xL，HO-1和Ref-1因子的表達(dá)，提示IL-22在GaIN／LPS誘導(dǎo)的肝損傷中可通過抗凋亡、抗氧化和抗炎癥等方式發(fā)揮保護(hù)作用。因此，我們推測慢性HBV肝衰竭患者中Th22和IL-22主要是代償性增高，以減少肝臟損傷程度。

由于本研究樣本量較小，肝衰竭早期和中期患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度雖高于晚期患者，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著肝衰竭的進(jìn)展，Th22細(xì)胞和IL-22呈下降趨勢，我們推測，可能與機(jī)體代償能力有關(guān)。CHB至肝衰竭早期這個(gè)過程中，機(jī)體及肝臟具有一定的代償能力，損傷及炎癥反應(yīng)可刺激Th22細(xì)胞和IL-22的產(chǎn)生并發(fā)揮保護(hù)作用。而到了肝衰竭中晚期，隨著肝硬化、腹腔積液、肝性腦病等癥狀的出現(xiàn)，機(jī)體免疫功能及代償能力都會有所下降，當(dāng)損傷和炎癥反應(yīng)刺激時(shí)，Th22細(xì)胞和IL-22釋放減少，其水平比正常人還低。

ROC曲線分析顯示，Th22細(xì)胞在CHB患者中預(yù)測肝衰竭中的價(jià)值有限，而IL-22曲線下面積達(dá)到0.753（95% CI：0.598～0.907），提示IL-22可作為CHB預(yù)測肝衰竭發(fā)生的一個(gè)較好指標(biāo)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)、IL-22濃度和病毒復(fù)制指標(biāo)HBV-DNA無相關(guān)性。Zhang等［16］研究發(fā)現(xiàn)，對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠注射單劑量的IL-22，將使得肝臟促炎基因表達(dá)增加，但病毒表達(dá)水平無變化，提示IL-22不直接抑制HBV病毒的復(fù)制，這也可以解釋CHB肝衰竭患者Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度與HBV-DNA無相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度在肝衰竭患者中與ALT水平不相關(guān)，但與總膽紅素呈正相關(guān)。由于IL-22在肝細(xì)胞損傷時(shí)代償性增高，因此IL-22與肝臟損傷程度指標(biāo)總膽紅素呈正相關(guān)，而與ALT不相關(guān)主要考慮可能是肝衰竭患者ALT水平與肝臟炎癥及損傷并不一定相關(guān)。

綜上所述，Th22細(xì)胞及相關(guān)因子IL-22在CHB肝衰竭患者中異常表達(dá)，可能參與了肝衰竭的發(fā)病機(jī)制。IL-22可作為CHB患者肝衰竭發(fā)生的一個(gè)預(yù)測指標(biāo)。監(jiān)測肝衰竭患者外周血Th22細(xì)胞頻數(shù)和IL-22濃度對肝臟損傷程度的判斷具有一定意義。今后我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，動態(tài)觀察治療前后Th22細(xì)胞和IL-22的變化，評價(jià)其在疾病療效及預(yù)后中的價(jià)值。