敖漢細(xì)毛羊Hoxa5、BMPR1B基因互作研究

張夢(mèng)瑤，楊 峰，劉積鳳，劉開東，賀建寧，柳 楠

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266121；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

我國(guó)在20世紀(jì)80年代開始育種細(xì)毛羊，其中的敖漢細(xì)毛羊在敖漢、翁牛特旗縣開始繁育，父母系均來自于不同的細(xì)毛羊品種，父本通常以美利奴羊?yàn)橹鱗1]。毛囊是皮膚的一附屬結(jié)構(gòu)，它的形成是上皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞間相互作用的結(jié)果。在羊毛產(chǎn)量上皮膚和毛囊的性狀起到了重要的作用，因此了解皮膚結(jié)構(gòu)和毛囊的發(fā)育規(guī)律對(duì)細(xì)毛羊生產(chǎn)顯得尤為重要[2]。毛囊的調(diào)控也受多種因子影響，因此探究毛囊生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控基因也顯得非常重要。

Hox(Homeobox)基因又稱為同源異型盒基因(Homeotic gene)，是胚胎復(fù)雜的遺傳系統(tǒng)的中心，在胚胎發(fā)育過程中，它通過相應(yīng)的信號(hào)指揮胚胎的發(fā)生[3]，發(fā)出信號(hào)作用于不同部位的細(xì)胞，使得細(xì)胞在分化的過程中接收到來自Hox基因的信號(hào)，能夠保證各個(gè)部位分化出正常的組織和器官，是發(fā)育遺傳學(xué)研究的前沿陣地[4]。Hox家族是動(dòng)物基因組內(nèi)高度保守的一類轉(zhuǎn)錄因子[5]，目前共有39個(gè)[6]，不但在動(dòng)物體軸形成過程中扮演著重要的角色，對(duì)毛囊細(xì)胞增殖分化也起著重要作用[7-9]，是一類重要的發(fā)育調(diào)控基因。通過對(duì)人和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)Hox家族的基因均在皮膚和毛囊中表達(dá)[10]。Hoxa5能夠?qū)γ壹?xì)胞的增殖、分化發(fā)出信號(hào)[9]，從而能夠阻斷毛囊在退行期時(shí)的其他信號(hào)的傳遞，延滯了毛囊的周期發(fā)育[11]。Hox基因數(shù)目多少、序列的多樣性及其表達(dá)模式直接決定了動(dòng)物的生態(tài)多樣性，因此Hox基因在模式生物系統(tǒng)中的研究相對(duì)較廣泛。Hoxa5在控制毛生長(zhǎng)發(fā)育中有重要作用，當(dāng)缺少或過表達(dá)時(shí)，小鼠都會(huì)表現(xiàn)出毛生長(zhǎng)的缺陷[12]。BMPs本身是一種蛋白，BMPs在骨的形成過程中發(fā)揮著重要的作用，通過誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞使其分化成骨，也可以通過誘導(dǎo)促進(jìn)脂肪細(xì)胞向骨細(xì)胞分化從而成骨，也有促進(jìn)胚胎成纖維細(xì)胞的分化，進(jìn)一步分化形成骨骼[13]。有研究表明，BMPs對(duì)毛囊細(xì)胞的發(fā)育也有一定的影響，初步得到對(duì)毛囊的發(fā)育是抑制作用，至于在哪個(gè)時(shí)期還有待研究。BMPR1B基因?qū)儆贐MPs家族的Ⅰ型受體因子，同樣它也調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞等的代謝。近來在綿羊多產(chǎn)基因分子機(jī)制上的研究較多，表明骨形態(tài)發(fā)生蛋白及其受體對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育具有重要影響。在毛囊生長(zhǎng)發(fā)育上，BMPR1B基因在初級(jí)毛囊的毛母質(zhì)、內(nèi)根鞘和毛干等均可以表達(dá)，在次級(jí)毛囊的內(nèi)根鞘和絨干也將表達(dá)[14]，這為研究提供了一定的基礎(chǔ)。

目前，在敖漢細(xì)毛羊身上基因的研究主要集中在肌肉方面，選取優(yōu)良基因?qū)∪饧±w維粗細(xì)的影響，對(duì)于有關(guān)皮膚毛囊的基因研究還相對(duì)較少，有一部分研究也只局限在分子水平上，通過基因mRNA的表達(dá)量來初步判斷基因的作用；還有一部分是與毛囊無關(guān)的研究。本研究不僅從單個(gè)基因的mRNA水平和蛋白水平上對(duì)功能進(jìn)行鑒定，并且著重對(duì)Hoxa5、BMPR1B兩基因之間的相互作用關(guān)系進(jìn)行了鑒定，以分析兩者之間的上、下調(diào)關(guān)系，從而進(jìn)一步為基因通路的研究提供一定的基礎(chǔ)，為基因在個(gè)體層次上的研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取健康40日齡的胎羊。

1.2 主要試驗(yàn)試劑及儀器

PeM-T、pcDNA3.1質(zhì)粒、Lipofectamine2000、高糖培養(yǎng)液等均購(gòu)自青島鑫宇恒一有限公司。BB5060UV 型賀氏二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于德國(guó)Eppendorf公司，Western Blot、熒光定量PCR系統(tǒng)均購(gòu)自Bio-Rad公司[15]。

1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增 從NCBI中查找綿羊的Hoxa5(GenBank登錄號(hào)為NM-015095103.2)、BMPR1B(GenBank登錄號(hào)為NM-001009431.1)基因全序列，選取Hoxa5基因和BMPR1B基因的CDS區(qū)，利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)2個(gè)基因的引物。設(shè)計(jì)同時(shí)需在上下游引物5′端加入保護(hù)堿基和EcoR Ⅰ、KpnⅠ酶切位點(diǎn)，最終完成的Hoxa5引物序列為：

上游引物：5′-CCGGAATTCATGAGCTCTTATTTT GTAAAC-3′；

下游引物：5′-CGGGGTACCTAAACGCTCAAATA CTCAGG-3′。

在BMPR1B上下游引物5′端加入EcoR Ⅰ、NdeⅠ酶切位點(diǎn)，最終完成的引物序列為：

上游引物：5′-CCGGAATTCATGCTTCAGGTTTG CGAAGT-3′；

下游引物5′-GGAATTCCATATGTCAGATGTCC TGTCTAAGGG-3′[15]。

利用TRIzol裂解成纖維細(xì)胞，按照試劑盒說明提取細(xì)胞RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。擴(kuò)增體系為20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，金牌Mix 17 μL。

1.3.2 TA克隆 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳回收，對(duì)DNA片段進(jìn)行加A，反應(yīng)體系為：目的片段15 μL、Tailing-A ReactionBuffer 4 μL、TapDNA Polymerase 1 μL。TA克隆連接體系為：T4DNA連接酶2 μL、T4Buffer 1 μL、T載體2 μL、目的片段5 μL、水浴16 ℃ 3 h，4 ℃ 12 h。取50 μL DH5ɑ與5 μL T連接液混勻冰浴20 min；42 ℃熱激90 s，冰浴15 min；加入400 μL LB培養(yǎng)基(不含AMP抗生素)37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)1 h，去上清，將細(xì)胞均勻分散在含有AMP抗生素的培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置12 h，挑取單菌進(jìn)行10 h搖菌[16]。

1.3.3Hoxa5、BMPR1B基因與pcDNA3.1質(zhì)粒重組 對(duì)TA克隆載體分別進(jìn)行EcoR Ⅰ、NdeⅠ雙酶切和EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切，酶切體系為：EcoRⅠ內(nèi)切酶1 μL；NdeⅠ內(nèi)切酶1 μL；KpnⅠ內(nèi)切酶1 μL；TA克隆載體和pcDNA3.1 5 μL；Buffer 1 μL加水補(bǔ)足到50 μL體系。37 ℃ 2 h，對(duì)Hoxa5、BMPR1B基因及切開的pcDNA3.1質(zhì)粒進(jìn)行膠回收，取Hoxa5、BMPR1B基因各5 μL，3 μL pcDNA3.1，加入1 μL T4DNA連接酶及1 μL T4DNA連接酶Buffer，22 ℃金屬浴2 h，16 ℃ 3 h，后轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中過夜培養(yǎng)，選取單個(gè)菌落進(jìn)行搖菌，利用簡(jiǎn)單PCR鑒定菌液中是否含有目的基因，對(duì)含有的菌液進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)[16]。

1.4 敖漢細(xì)毛羊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)

從懷孕的母體中取出完整的40日齡胎羊，用75%酒精對(duì)胎兒清洗幾遍，再用PBS進(jìn)行清洗并保存。帶回細(xì)胞間后用75%的酒精清洗，再用含有雙抗的PBS清洗。對(duì)30日齡的胎羊只留軀干，將軀干分成直徑1.0～1.5 cm，并在分離的組織上滴加適當(dāng)?shù)奶ヅＱ?，覆蓋組織即可，37 ℃，5.0% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 h，之后在培養(yǎng)基加入適當(dāng)?shù)母咛桥囵B(yǎng)液。24 h后先觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好，則給細(xì)胞進(jìn)行換培養(yǎng)液[15]。待細(xì)胞密度達(dá)95%，去除廢舊培養(yǎng)液用預(yù)熱含有雙抗的PBS洗滌幾遍，每個(gè)平板中加入1 mL的胰蛋白酶，放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中消化，當(dāng)大量細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形時(shí)加入3 mL的培養(yǎng)液停止消化。根據(jù)細(xì)胞密度的大小進(jìn)行分板，繼續(xù)加入新鮮的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)95%后，再次進(jìn)行傳代[16]。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%左右時(shí)，去除舊的培養(yǎng)液，用不含抗生素的PBS清洗幾遍，利用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，共轉(zhuǎn)染組和單轉(zhuǎn)染組分別取其20 μL脂質(zhì)體試劑，加入480 μL DMEM(不含雙抗)，混勻，靜置5 min，在共轉(zhuǎn)染組中分別加入20 μL的Hoxa5、BMPR1B質(zhì)粒，460 μL高糖培養(yǎng)基(不含雙抗)，單轉(zhuǎn)染組加40 μL質(zhì)粒，460 μL高糖培養(yǎng)基，孵育15～20 min，加入4 mL 高糖培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h，換含有雙抗的高糖培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)36 h[18]。

1.6 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)正常培養(yǎng)48 h，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)收集細(xì)胞，去除培養(yǎng)基用PBS清洗幾遍，每平板中加入 3 mL的TRIzol裂解成纖維細(xì)胞，按照試劑盒說明提取細(xì)胞RNA。其濃度和純度處于正常范圍時(shí)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄[15-16]，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。通過NCBI查找綿羊Hoxa5、BMPR1B基因的CDS區(qū)和綿羊GAPDH的CDS區(qū)，利用PrimerPremier 5.0分別設(shè)計(jì)Hoxa5、BMPR1B和GAPDH基因的特異性熒光定量引物，序列如表1。

利用設(shè)計(jì)的熒光定量引物和反轉(zhuǎn)錄的cDNA對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行定量檢測(cè)。試驗(yàn)組和對(duì)照組各設(shè)置3次重復(fù)，2個(gè)基因分別點(diǎn)36 μL，每孔總量5 μL；退火溫度設(shè)置為60 ℃；結(jié)果數(shù)據(jù)利用公式Ct(2-ΔΔCt)計(jì)算，從而計(jì)算出Hoxa5、BMPR1B的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量的數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析，以P<0.01作為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)[15-16]。

表1 引物信息Tab.1 Primers information

1.7 Western Blotting檢測(cè)Hoxa5、BMPR1B基因蛋白質(zhì)表達(dá)

首先用細(xì)胞裂解液PARI裂解提取成纖維細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，目的基因Hoxa5、BMPR1B和內(nèi)參基因β-actin分別點(diǎn)3個(gè)膠孔，先進(jìn)行2.5 h的電泳；電泳后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行PVDF轉(zhuǎn)膜，用轉(zhuǎn)膜電泳槽進(jìn)行2～3 h，完全轉(zhuǎn)膜后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行封閉2 h；封閉后用TBST進(jìn)行洗膜3次；對(duì)一抗進(jìn)行1∶2 000的比例稀釋，在4 ℃冰箱用一抗孵育PVDF膜12 h；一抗孵育完后進(jìn)行二抗的孵育，對(duì)二抗進(jìn)行1∶2 000的比例稀釋，孵育1.5 h；孵育完成后進(jìn)行曝光，A液和B液按照1∶1的比例混合，避光進(jìn)行壓膜，利用AIC曝光拍照。對(duì)曝光后的蛋白條帶用ImageJ 軟件進(jìn)行灰度值分析，得出目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Hoxa5、BMPR1B目的基因的擴(kuò)增

利用反轉(zhuǎn)錄的cDNA和上下游引物對(duì)目的基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以獲得Hoxa5、BMPR1B目的片段。電泳結(jié)果如圖1所示，其擴(kuò)增出的片段明亮且無雜帶，Hoxa5條帶大小約為804 bp，BMPR1B條帶大小約為1 509 bp，均與已知的目的片段大小相同，可用于后期的連接試驗(yàn)。

M.2000 Marker；1.BMPR1B基因擴(kuò)增條帶(1 509 bp)；2.Hoxa5基因擴(kuò)增條帶(804 bp)。M.2000 Marker；1.BMPR1B product(1 509 bp)；2.Hoxa5 product(804 bp).

2.2 TA克隆測(cè)序比對(duì)

將獲得的Hoxa5、BMPR1B基因片段分別與T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h。對(duì)菌液的序列進(jìn)行測(cè)序，將目的基因的序列與測(cè)序所得的序列用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖2所示，菌液中的堿基序列與已有目的序列完全一致，堿基沒有發(fā)生缺失。

Query.已知序列； Sbjct.目的基因序列。圖6同。Query.Known sequence; Sbjct.Target gene sequence.The same as Fig.6.

2.3 克隆載體的鑒定

利用試劑盒對(duì)連接好的T-Hoxa5、T-BMPR1B克隆載體進(jìn)行提取，提取后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，Hoxa5基因大小為804 bp，T載體大小為3 489 bp，連接上目的基因后應(yīng)在4 293 bp處，BMPR1B基因大小為1 509 bp，T載體大小為3 489 bp，連接上目的基因后應(yīng)在4 998 bp處，條帶清晰單一，結(jié)果顯示克隆載體提取成功，可用于后續(xù)的酶切試驗(yàn)。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆載體(4 998 bp)；3-4.Hoxa5克隆載體(4 293 bp)。M.5000 Marker；1-2.BMPR1B cloning vector(4 998 bp);3-4.Hoxa5 cloning vector(4 293 bp).

2.4 克隆載體、pcDNA3.1載體雙酶切

對(duì)克隆載體和pcDNA3.1載體分別進(jìn)行雙酶切，克隆載體的雙酶切將目的基因片段切下，pcDNA3.1的雙酶切把載體切開，對(duì)兩者雙酶切之后的片段進(jìn)行切膠回收用于后續(xù)的連接。結(jié)果如圖4所示，1-4酶切效果良好，1-2是對(duì)BMPR1B克隆載體的EcoRⅠ、NdeⅠ雙酶切，目的基因?yàn)? 509 bp，T載體為3 489 bp,與圖中條帶所吻合。3-4是對(duì)Hoxa5克隆載體的EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切，目的基因?yàn)?04 bp，T載體為3 489 bp,與圖中條帶所吻合。5-6是對(duì)pcDNA3.1的雙酶切，大小為5 428 bp，圖中條帶與已知大小所吻合。因此目的基因可與表達(dá)載體pcDNA3.1進(jìn)行連接。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1B克隆載體EcoR Ⅰ、NdeⅠ雙酶切；3-4.Hoxa5克隆載體EcoR Ⅰ、KpnⅠ雙酶切；5-6.pcDNA3.1載體雙酶切。

M.5000 Marker；1-2.BMPR1Bcloning vectorEcoRⅠ,NdeⅠ double digestion;3-4.Hoxa5cloning vectorEcoRⅠ,KpnⅠ double digestion;5-6.pcDNA3.1 vector double digestion.

圖4 克隆載體及pcDNA3.1載體雙酶切
Fig.4 Cloning vector and pcDNA3.1 vector double digestion

2.5 表達(dá)載體pcDNA3.1構(gòu)建及鑒定

將克隆載體酶切下的BMPR1B、Hoxa5目的片段與pcDNA3.1載體進(jìn)行連接，連接后進(jìn)一步轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，對(duì)所得的菌液進(jìn)行普通PCR鑒定，電泳結(jié)果條帶清晰單一，大小約在804 bp處(圖5)，與已知的Hoxa5基因相符；另在1 059 bp處也有單一明亮的條帶，與已知的BMPR1B基因相符。說明BMPR1B、Hoxa5與pcDNA3.1載體連接成功。

M.2000 Marker；1-2.BMPR1B;3-4.Hoxa5。

2.6 表達(dá)載體菌液測(cè)序鑒定

獲得pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B表達(dá)載體的菌液，對(duì)菌液中質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，與已知目的基因的序列進(jìn)行比較匹配，堿基未發(fā)生缺失、添加現(xiàn)象，完全一致(圖6)。結(jié)果表明，目的基因與pcDNA3.1載體連接成功，且目的基因能夠穩(wěn)定地存在于pcDNA3.1載體中。

2.7 細(xì)胞形態(tài)觀察

2.7.1 原代培養(yǎng)形態(tài)觀察 通過組織塊法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。24 h進(jìn)行細(xì)胞的觀察，可以觀察到細(xì)胞開始慢慢貼壁，也有少數(shù)游離的組織，貼壁的細(xì)胞形狀不完全是梭形，以梭形居多，還有其他形狀的雜細(xì)胞(圖7)。培養(yǎng)96 h可見培養(yǎng)皿的底部細(xì)胞密度約為95%，此密度可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。

2.7.2 傳代培養(yǎng)形態(tài)觀察 細(xì)胞呈指數(shù)增長(zhǎng),細(xì)胞密度不易過大，因此需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，否則會(huì)引起抑制生長(zhǎng)現(xiàn)象。一般在3 d左右細(xì)胞的密度可達(dá)90%～95%，此時(shí)即可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代。利用胰蛋白酶將貼壁的細(xì)胞消化成懸浮狀態(tài)，分離到其他平板中，前12 h內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的速度會(huì)比較緩慢，12 h后生長(zhǎng)將迅速增快，大多數(shù)細(xì)胞基本保持梭形，如圖8所示。

圖6 BMPR1B(A)、Hoxa5(B)菌液測(cè)序比對(duì)Fig.6 BMPR1B(A)，Hoxa5(B) bacterial sequencing comparison

圖7 原代培養(yǎng)24 h(×100)Fig.7 Primary culture 24 h(×100)

圖8 成纖維細(xì)胞傳代培養(yǎng)(×100)Fig.8 Fibroblasts subculture(×100)

2.8 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)Hoxa5、BMPR1B基因表達(dá)

對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用熒光定量引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增Hoxa5、BMPR1B和GAPDH片段。電泳分析結(jié)果如圖9所示，擴(kuò)增出的條帶明亮且單一，GAPDH擴(kuò)增的條帶大約在128 bp處，Hoxa5擴(kuò)增的條帶大約在186 bp處，BMPR1B條帶大小約在198 bp處，因此可繼續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。

由圖 10可知，兩目的基因Hoxa5、BMPR1B和內(nèi)參基因GAPDH的熔解曲線上均未出現(xiàn)雜亂的峰，且只有1個(gè)峰，擴(kuò)增曲線比較集中統(tǒng)一，此圖表明設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物特異性良好，因而能夠獲得單一特定產(chǎn)物[15]。對(duì)共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和單轉(zhuǎn)染的細(xì)胞mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，Hoxa5基因共轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)量明顯升高，BMPR1B基因共轉(zhuǎn)染后mRNA表達(dá)量明顯下降，Hoxa5、BMPR1B共轉(zhuǎn)染與單轉(zhuǎn)染比較均差異極顯著(P<0.01)，見圖11。

圖10 Hoxa5、BMPR1B、GAPDH 擴(kuò)增曲線圖(A)和熔解曲線峰值圖(B)Fig.10 Hoxa5,BMPR1B,GAPDH amplification (A) and melting curve(B)

不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。圖13同。The different capital letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01).The same as Fig.13.

2.9 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白表達(dá)的檢測(cè)

對(duì)單、共轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白的提取，然后進(jìn)行Western Blot。將Hoxa5、BMPR1B基因共轉(zhuǎn)染與單轉(zhuǎn)染進(jìn)行比較，Hoxa5共轉(zhuǎn)染的蛋白條帶明顯亮于單轉(zhuǎn)染的對(duì)照組，BMPR1B共轉(zhuǎn)染的蛋白條帶明顯暗于單轉(zhuǎn)染對(duì)照組(圖12)。利用ImageJ分析的蛋白條帶的灰度值有所不同，通過SPSS分析灰度值數(shù)據(jù)差異顯著性，得出細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Hoxa5基因蛋白表達(dá)量極顯著高于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)(圖13)，共轉(zhuǎn)染的BMPR1B基因蛋白表達(dá)量極顯著低于單轉(zhuǎn)染(P<0.01)。

圖12 Hoxa5、BMPR1B基因表達(dá)蛋白條帶Fig.12 Hoxa5,BMPR1B gene expression protein product

圖13 Hoxa5、BMPR1B基因蛋白相對(duì)表達(dá)量Fig.13 Hoxa5，BMPR1B gene protein relative expression

3 討論與結(jié)論

許多的信號(hào)相互傳遞著多個(gè)細(xì)胞群之間的信號(hào)反應(yīng)，這些信號(hào)分子決定著毛囊的發(fā)育，它們使毛囊細(xì)胞進(jìn)行著有序地增殖和分化，使之形成完整的毛囊結(jié)構(gòu)[19]。毛囊形態(tài)發(fā)生是由真皮發(fā)出原始信號(hào)[20]，在毛囊基板形成的起始階段，必須先激活皮膚中Wnt信號(hào)[21-22]。有研究表明，部分上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖受Eda類因子和下游的轉(zhuǎn)錄因子活性的影響[23-24]。目前，調(diào)節(jié)毛囊形態(tài)發(fā)生變化的信號(hào)分子有7類，以骨形成蛋白(BMP)信號(hào)家族、Wnt通路等為主線，其他信號(hào)通路相互調(diào)和控制，在單信號(hào)通路中，也是2個(gè)及以上基因進(jìn)行調(diào)節(jié)，很少出現(xiàn)單個(gè)基因的調(diào)控，相應(yīng)的呈現(xiàn)抑制或促進(jìn)不同的作用。BMPR1B基因?qū)儆贐MP家族，是一種促進(jìn)物，對(duì)毛囊的發(fā)育起到了一定的促進(jìn)作用，Hoxa5基因?qū)儆赥NF家族，是一種抑制物，對(duì)毛囊的發(fā)育起到了一定的抑制作用，現(xiàn)在對(duì)單個(gè)基因作用的研究有所存在，對(duì)2個(gè)基因以及多個(gè)基因作用的研究相對(duì)較少，通過對(duì)它們之間的相互作用來篩選良性基因，促進(jìn)羊毛的生產(chǎn)。

也有學(xué)者對(duì)單個(gè)基因功能進(jìn)行過鑒定，Hoxa5屬于Hox家族，得到Hoxa5對(duì)脂肪的代謝調(diào)節(jié)作用，間接控制脂肪粒細(xì)胞中的信號(hào)因子發(fā)揮作用，也有結(jié)論得出Hoxa5基因的信號(hào)調(diào)節(jié)對(duì)胚胎的發(fā)育有重要的影響，對(duì)造血干細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)控制起主導(dǎo)作用。Hoxa5對(duì)毛囊的發(fā)育也有相應(yīng)的鑒定，是否影響其他與毛囊發(fā)育相關(guān)的基因，本試驗(yàn)利用BMPR1B基因和它進(jìn)行相互作用的研究，BMPR1B本身對(duì)毛囊的發(fā)育有一定的促進(jìn)作用，Hoxa5的存在以及過表達(dá)是否會(huì)有利于BMPR1B基因的表達(dá)。通過試驗(yàn)結(jié)果分析兩者的相互作用關(guān)系，Hoxa5基因的過表達(dá)對(duì)BMPR1B基因起到了一定的抑制作用，使得促進(jìn)羊毛發(fā)育的基因受到了抑制，因此兩者同時(shí)的過表達(dá)不利于羊毛的生長(zhǎng)，以后的羊毛生產(chǎn)過程中盡量避開抑制性基因的過表達(dá)。

Hoxa5、BMPR1B單個(gè)基因功能的鑒定出現(xiàn)過，但與毛囊發(fā)育功能的鑒定較少。Hoxa5、BMPR1B基因兩者之間相互作用關(guān)系的研究未曾出現(xiàn)過，本研究可以從mRNA水平和蛋白水平上來鑒定兩者之間的作用關(guān)系。本研究通過表達(dá)載體的構(gòu)建成功的構(gòu)建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到敖漢細(xì)毛羊的成纖維細(xì)胞中，觀察細(xì)胞的形態(tài)以及測(cè)定相應(yīng)表達(dá)指標(biāo)，從而進(jìn)一步研究基因的作用以及兩者之間的相互作用關(guān)系。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，Hoxa5、BMPR1B基因的mRNA和蛋白表達(dá)量均有明顯的升高，初步驗(yàn)證了通過載體構(gòu)建后基因過表達(dá)。單方面研究Hoxa5基因，得知Hoxa5基因能夠抑制毛囊的發(fā)育，作為和其他基因之間是否存在促進(jìn)或拮抗作用有待研究，本試驗(yàn)通過與BMPR1B基因的共同研究得出Hoxa5基因自身過表達(dá)的同時(shí)也將會(huì)影響其他信號(hào)通路中的基因，至于是促進(jìn)還是拮抗則根據(jù)它們的表達(dá)量來判斷[18]。

本研究分別對(duì)Hoxa5、BMPR1B基因表達(dá)載體進(jìn)行構(gòu)建，轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot等檢測(cè)mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果成功地構(gòu)建了pcDNA3.1-Hoxa5、pcDNA3.1-BMPR1B，并且共轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞Hoxa5基因的表達(dá)量明顯升高，BMPR1B的mRNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均明顯下降，且共轉(zhuǎn)染組的表達(dá)量極顯著低于單轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，因而推測(cè)Hoxa5基因抑制了BMPR1B基因的表達(dá)，BMPR1B基因促進(jìn)了Hoxa5基因的表達(dá)，為進(jìn)一步在個(gè)體水平上研究其功能奠定基礎(chǔ)。