基于高通量測序的藜麥連作根際土壤微生物多樣性研究

董艷輝,于宇鳳,溫 鑫,王亦學,聶園軍,侯麗媛,李亞莉,劉 江,任 元,王育川,曹秋芬,吳慎杰,王 斌,秦永軍

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究中心，山西 太原 030031；2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，山西 太原 030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所，山西 太原 030031；4.山西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)作物品種資源研究所，山西 太原 030031;5. 山西省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030031)

連作是農(nóng)民常用的一種簡單、長期、有效地提高土地利用率獲取經(jīng)濟利益的一種做法，藜麥屬于莧科植物，作為一種引進于南美的全營養(yǎng)作物，營養(yǎng)價值高，被列為全球十大健康食物之一[1]，2008年，我國山西開始引種并試種成功，山西靜樂作為藜麥產(chǎn)業(yè)的首個生產(chǎn)基地，目前種植面積已經(jīng)超過0.2萬hm2，且甘肅、內(nèi)蒙古、青海、吉林、河北、寧夏等省份種植面積也在逐漸擴大[2]。由于藜麥作為一種有著較高營養(yǎng)價值的新型雜糧，市場前景比較廣闊，相對于其他作物有較高的經(jīng)濟收入，農(nóng)民對種植藜麥的熱情比較高，在土地資源有限的情況下對藜麥進行連年種植，然而，藜麥第2年重茬種植就會出現(xiàn)出苗率低、植株生長緩慢、病蟲害加重、產(chǎn)量急劇下降等現(xiàn)象，采取土壤簡單消毒、增施底肥等措施后效果也不明顯。藜麥連作障礙現(xiàn)象在藜麥大規(guī)模種植地區(qū)基本都存在，導致個體種植戶和藜麥種植公司有著不同程度的損失，科研人員進行了各方面的嘗試，但因為對藜麥各方面的研究還處于初級階段，目前還沒有很好的解決辦法。馬紅梅等[3]對連作靈芝土壤微生物研究表明，連作改變了靈芝栽培土壤中原來的微生態(tài)平衡，特別是病原真菌改變了原有的土壤微生境，但具體是哪一種菌還有待進行進一步的分子鑒定。薛超等[4]總結了大量前人對連作機制的研究后認為，施用有機肥尤其是將有機肥與功能微生物相結合制成微生物有機肥后施用，對土傳病害有一定的防治作用，但效果不是太穩(wěn)定。

藜麥作為抗逆性較強的新型雜糧作物，我國引進的時間較短，對其生理生化特性以及遺傳機制了解還不夠深入，面對產(chǎn)生的連作障礙問題，很難達到對癥下藥，但根際土壤是根際微生物直接作用于植物的重要場所，也是根際微生物受植物根系和分泌物影響最直接的區(qū)域，作物根際微生物能夠分解并轉(zhuǎn)化根際養(yǎng)分供給植物根系吸收，提高植物對生物和非生物脅迫的抵抗力[5-7]。夏圍圍等[8]比較了新一代高通量測序技術與傳統(tǒng)的變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)指紋圖譜技術，評價了這2種技術研究土壤微生物群落結構的優(yōu)缺點，在不同的微生物分類水平，高通量測序草地土壤檢測到22門、54綱、60目、131科、350屬；而DGGE僅檢測到6門、9綱、8目、10科、10屬、表明DGGE顯著低估了土壤微生物的群落組成。

新一代高通量測序技術的發(fā)展擺脫了研究土壤微生物分離培養(yǎng)的瓶頸，使得根際微生物和連作障礙之間的關系再次成為研究的熱點。本試驗采用新一代高通量測序技術，以靜樂縣娑婆鄉(xiāng)連作藜麥試驗地為研究對象，分析了第1年種植藜麥與重茬種植藜麥的根際土壤樣品的細菌種群豐度和多樣性的變化，并對細菌功能進行初步預測，試圖探索藜麥連作障礙與土壤根際細菌之間的關系，以期了解藜麥連作對根際土壤細菌菌群多樣性的影響，探究藜麥連作障礙機制，旨在從藜麥根際土壤微生物方面入手為藜麥的生產(chǎn)實踐和可持續(xù)種植提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地選取我國藜麥之鄉(xiāng)靜樂縣娑婆鄉(xiāng)，于2015-2016年連續(xù)在同一地塊進行試驗。該地屬于溫帶季風氣候，夏季暖熱且晝夜溫差大，冬季寒冷，年降雨量380～500 mm，無霜期120～135 d。

1.2 試驗方法

用無菌毛刷將藜麥根際土壤刷進無菌自封袋內(nèi)，去除石塊、大顆粒等雜質(zhì)，同時在根周圍用無菌鏟取土壤放入無菌袋內(nèi)，去除石塊、大顆粒等雜質(zhì)。每個重復取1個土壤樣品，每個土壤樣品取3個取樣點然后混合。取樣后立刻放入冰盒帶回實驗室，根際土壤放入-80 ℃冰箱用于DNA提取。

試驗設2個處理，處理1為種植1 a的藜麥田(2016年)，該處理設3次重復，編號分別為11，12，13，處理2為重茬種植的藜麥田(2015，2016年)，該處理設3次重復，編號分別為C11、C12、C13。

1.3 土壤細菌的16S rRNA基因測序

1.3.1 DNA的提取及16SrRNA基因V4區(qū)片段的擴增 利用土壤DNA提取試劑盒提取6個樣本的DNA，針對16SrRNA基因的V4區(qū)域進行PCR擴增預試驗，然后進行大量PCR擴增試驗。上游引物為530F(5′-AYTGGGYDTAAAGNG-3′)；下游引物為805R(5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′)；PCR反應體系為：Q5高保真DNA聚合酶：0.25 μL，反應緩沖液 5 μL，高GC緩沖液 5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，模板 DNA 1 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，水11.25 μL；PCR擴增程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min結束。

1.3.2 PCR產(chǎn)物純化與定量 對通過PCR聚合酶鏈式反應獲得不同土壤樣品的PCR產(chǎn)物后，進行瓊脂糖凝膠電泳分析，針對目標條帶進行割膠回收，獲得純化的PCR產(chǎn)物。

1.3.3 文庫驗證及測序 利用熒光分光光度計方法定量DNA，通過Agilent 2100對富集片段進行電泳完成質(zhì)量控制，驗證DNA文庫片段大小及分布規(guī)律(Agilent 2100 bioanalyzer，Agilent 2100;Agilent High Sensitivity DNA Kit,Agilent, 5067-4626)，然后送至上海派森諾生物科技有限公司，在Illumina-MiSeq平臺上進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

為獲得更為精準、高質(zhì)量的生物學信息，首先對原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，獲得最終用于分析的序列，然后應用QIIME軟件，根據(jù)序列97%的相似度，將序列歸并并劃分為多個OUTs，并利用軟件Mothur計算豐富度指數(shù)Chao1和ACE以及多樣性指數(shù)Simpson和Shannon，并進行Alpha多樣性分析，同時進行細菌群落分布、聚類分析和細菌功能預測分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理土壤樣本測序結果及質(zhì)量控制

高通量測序結果顯示，6個樣本共獲得有效序列276 400條(Sequences)，運用QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http://qiime.org/)剔除序列長度<150 bp的序列和 5′端引物錯配堿基數(shù)> 1的序列以及含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列，然后調(diào)用USEARCH軟件檢查并剔除嵌合體序列。按照優(yōu)化標準，去除不合格序列后共得到高質(zhì)量序列251 346條，每個樣本高質(zhì)量序列占有效序列的比例都在89%以上(表1)。高質(zhì)量序列用于樣本間微生物豐富度和多樣性的評估。

表1 各樣本序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.1 Statistics of sample sequences datas

稀疏曲線(Dilution curve)揭示了每個樣品的取樣深度，可以用來評價當前測序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性。從圖1可以看出，當測序量超過40 000讀長時，仍然會有新的OUTs出現(xiàn)，但是由于曲線已經(jīng)趨于平緩，表明該樣品取樣基本合理，在真實的環(huán)境中細菌群落結構的置信度比較高，能夠比較真實地反映土壤中的細菌群落多樣性，即當前測序深度足以反映該群落樣本所包含的細菌群落多樣性。

圖1 各土壤樣品的稀疏曲線(97%)Fig.1 Dilution curve of each soil sample(97%)

2.2 不同處理土壤細菌群落豐富度和多樣性分析

利用Alpha多樣性分析土壤中細菌群落的豐富度和多樣性，各土壤樣本的群落豐富度指數(shù)Chao1和ACE以及兼顧群落均勻度指數(shù)Shannon和Simpson如表2所示。

表2 土壤樣本中細菌豐富度和多樣性指數(shù)Tab.2 Index of the bacteria OUTs′ abundance and diversity in soil samples

就物種豐富度而言，種植1 a藜麥的土壤樣本較種植2 a的土壤樣本Chao1指數(shù)平均值增加16.4%，ACE指數(shù)平均值增加22.9%，表明種植2 a的土壤中細菌的物種豐富度大量減少，這與大部分研究結果一致。說明細菌物種豐富度減少可能是導致藜麥連作障礙的原因之一。 Simpson指數(shù)顯示，種植1 a的土壤較種植2 a的土壤Simpson指數(shù)平均值增加0.4%，變化不明顯，表明二者土壤中細菌群落的均勻度和優(yōu)勢OUTs數(shù)變化不明顯；而Shannon指數(shù)顯示，種植1 a的土壤較種植2 a的土壤Shannon指數(shù)平均值增加2.3%，表明種植1 a藜麥的土壤細菌群落多樣性和稀有OUTs較種植2 a藜麥的土壤要高，說明重茬種植后不僅導致土壤細菌多樣性下降，還導致部分稀有細菌種群多樣性減少；土壤細菌在土壤養(yǎng)分循環(huán)的各個環(huán)節(jié)占有重要地位，其數(shù)量的下降和群落結構的變化均會引起微生物功能的失調(diào)，進而導致土壤養(yǎng)分和肥力的下降，這與徐雪雪[9]的研究結果基本一致。

2.3 不同處理土壤菌群的分類學組成分析

將各分類水平的群落組成數(shù)據(jù)根據(jù)分類單元的豐度分布或樣本間的相似程度加以聚類分析并繪制熱圖(圖2)，種植1 a藜麥的土壤樣品和種植2 a藜麥的土壤樣品分別聚類在不同的類別，說明樣品一致性較好，有一定的代表性。聚類結果表明，重茬種植后倫茨氏菌屬(Lentzea)、溶桿菌屬(Lysobacter)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、極地單胞菌屬(Polaromonas)多樣性增多；分枝桿菌屬(Mycobacterium)、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、浮霉菌屬(Planctomyces)等細菌多樣性減少。增多和減少的細菌種群分屬不同的類別。其中，藤黃單胞菌屬細菌為革蘭氏陰性、好氧的棒狀桿菌，目前共有10個種。李廣寧等[10]分離出1株藤黃單胞菌屬細菌 HF-1127，通過研究該菌株的形態(tài)、培養(yǎng)特征、生理生化特征和遺傳特性，表明該細菌具有抗菌活性，其代謝產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抗性；范曉陽[11]從海水中分離出一種深淵藤黃單胞菌，研究表明，其可以降解明膠、淀粉、吐溫-20、吐溫-40以及吐溫-80等物質(zhì)；黃佩蓓等[12]對浮霉狀菌研究認為，浮霉狀菌屬細菌是一類具有重要生態(tài)作用的環(huán)境微生物，參與環(huán)境中的碳和氮的循環(huán)。

圖2 結合聚類分析的屬水平群落組成熱圖Fig.2 Heat map of the community composition in genus level combined with the cluster analysis

2.4 不同處理土壤樣品序列的菌群代謝功能預測

大量研究表明，土壤中的群落微生物功能組成與環(huán)境因子的相關度要大于物種組成與環(huán)境因子的相關度，在相似的環(huán)境條件下，雖然微生物群落的功能相似，但是行使功能的微生物組成差異反而較大，因此，在揭示土壤環(huán)境中的微生物群落組成的基礎上，最終要揭示微生物群落的功能。運用PICRUSt軟件通過將現(xiàn)有的群落組成數(shù)據(jù)與KEGG數(shù)據(jù)庫中微生物代謝功能的類別對比進行群落樣本功能預測[13]。由圖3可知，重茬種植后，行使環(huán)境信息處理功能類別中編碼細胞膜運輸?shù)墓δ芑虼罅繙p少；行使遺傳信息處理功能類別中編碼翻譯、復制和修復的功能基因大量減少；行使代謝功能類別中編碼異生素生物降解和代謝、聚糖生物合成和代謝的功能基因大量減少，編碼核苷酸代謝、萜類化合物和聚酮化合物的代謝、輔因子和維生素的代謝等功能基因少量減少；編碼信號轉(zhuǎn)導和脂質(zhì)代謝的功能基因有少量增加。

圖3 群落樣本的代謝功能預測圖Fig.3 Prediction map of the metabolic function in community samples

3 結論與討論

作物連作障礙產(chǎn)生的原因多且比較復雜，其中，土壤微生物豐富度和多樣性的變化是導致連作的主要原因之一。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物多樣性對維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡具有重要作用。由于技術的限制，早期對土壤微生物研究需要依賴于人工分離培養(yǎng)，而大部分土壤微生物無法在實驗室條件生存，因此阻礙了人們對微生物的了解，但是隨著技術的進步，尤其是下一代高通量測序技術的發(fā)展，不再依賴人工培養(yǎng)，使研究者們能夠同時對多種微生物基因組進行測序，通過對土壤根際微生物的豐富度和多樣性的研究有助于更好地研究微生物與作物生長發(fā)育的關系，為克服作物連作障礙提供數(shù)據(jù)支撐[14]。

藜麥重茬種植會導致根際土壤的細菌種群數(shù)量和多樣性都有不同程度的降低，同時也導致致病菌數(shù)量的增多，使根際土壤細菌種群朝著不利于植物生長的方向發(fā)展，這與大量作物連作障礙研究結果基本一致[15]。Bever等[16]根據(jù)多年的研究結果提出了土壤-植物反饋機制，該機制根據(jù)最終的結果又分為正反饋、負反饋和中性反饋。連作障礙的發(fā)生就是由于土壤與植物連續(xù)負反饋的結果。同時藜麥重茬種植后細菌種群結構也發(fā)生了變化，倫茨氏菌屬、溶桿菌屬、中慢生根瘤菌屬、叢毛單菌屬等細菌數(shù)量增多；分枝桿菌屬、藤黃單胞菌屬、芽單胞菌屬浮霉菌屬等細菌數(shù)量減少。據(jù)報道，溶桿菌屬細菌對線蟲和植物病害(革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性細菌、真菌等)具有生防作用，同樣具有固氮作用的中慢生根瘤菌屬細菌數(shù)量也有增加[17]。但是由于相關藜麥連作障礙方面的研究尚未見報道，因此可能是由于藜麥根際微環(huán)境比較適合溶桿菌屬細菌以及中慢生根瘤菌屬細菌的繁殖，導致了其數(shù)量的增加；但是參與土壤中碳和氮循環(huán)的浮霉菌屬細菌數(shù)量卻降低了，藜麥連作打破了藜麥根際土壤細菌之間的平衡，這可能導致藜麥根際土壤細菌功能性紊亂，從而負反饋于植株體本身，導致了藜麥的連作障礙，但具體的作用機制和相互之間的關系還需要進一步研究。

土壤根際微生物群落結構的差異會表現(xiàn)在基因表達方面的差異，藜麥重茬根際土壤中編輯復制和修復以及外源性物質(zhì)降解和代謝的功能基因大量減少，受環(huán)境條件的影響越來越大，導致細菌對外來入侵的抵抗能力大大減小，原來有益的細菌群落豐度顯著下降，病原菌細菌群落大量增殖，因此，導致重茬種植藜麥時生長受阻，土傳病害增加，產(chǎn)量急劇下降。也有研究表明[18]，連作不僅僅會導致有益細菌群落豐度降低，有益真菌的數(shù)量也會大幅度降低，而病原菌真菌的數(shù)量則會大幅度增加。由于藜麥連作障礙土壤根際細菌多樣性方面的研究尚未見報道，并且本研究所采用的高通量測序技術的第2代測序技術，對細菌的分類僅限于屬的水平，無法定位到某一種細菌，且同一屬的不同細菌種在土壤中可能會行使不同的功能，而不同屬的細菌也可能在土壤中行使同樣的功能，研究所得到的結果可能會有偏差。而隨著第3代測序技術(單分子測序技術)的進一步完善和發(fā)展，打開了一扇精準研究土壤微生物的大門，該技術已經(jīng)能夠?qū)⑼寥牢⑸锒ㄎ坏椒N的水平，對根際微生物的研究將會更加全面和細化，現(xiàn)在無法解決的問題可能會在不久的將來得到解決。

本研究中，利用高通量測序技術對2個處理6個樣本的土壤微生物進行了16SrRNA基因的V4區(qū)測序，然后對測序數(shù)據(jù)進行了處理和分析，該項研究的樣本量和測序深度在藜麥的相關研究中尚屬首次，能夠更加全面地揭示許多利用傳統(tǒng)分子生物學技術研究土壤微生物無法解決的問題，結果中獲得的土壤微生物多樣性變化基本上能夠揭示藜麥連作后土壤細菌種群多樣性的變化，并且預測了土壤細菌種群代謝功能的變化，為今后研究藜麥連作障礙機制提供參考，但由于本研究中測序深度即稀釋曲線并沒有達到完全飽和，處理中還有部分細菌種群沒有被發(fā)現(xiàn)。因此，本研究結果僅代表各個土壤樣品中的大部分細菌種群，今后仍有待開展更深層次的研究。