MYL3基因在肉牛肌肉生長(zhǎng)過程中的功能研究

劉瑞莉，吳 磊，袁 瑋，柏學(xué)進(jìn),3，呂娟娟,3，董雅娟,3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東 青島 266109；2.山東省黑牛繁育工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266109；3.山東布萊凱特黑?？萍脊煞萦邢薰?，山東 淄博 256306)

肌漿球蛋白(Myosin)是骨骼肌中重要的結(jié)構(gòu)蛋白和收縮蛋白，最早由Kuehne發(fā)現(xiàn)并命名，其中肌球蛋白輕鏈3(Myosin light chain 3,MLC1v或MYL3)編碼199個(gè)氨基酸，位于牛的22號(hào)染色體[1]。早期研究發(fā)現(xiàn)，MYL3結(jié)合Ca2+能夠促進(jìn)肌肉發(fā)育，并參與橫紋肌的收縮過程[2]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MYL3參與肌肉力量發(fā)育和神經(jīng)調(diào)節(jié)肌肉收縮的相關(guān)過程[3]。Meder等[4]研究斑馬魚時(shí)發(fā)現(xiàn)MYL3的C-末端絲氨酸殘基的磷酸化對(duì)心臟收縮具有重要意義。近期，人們對(duì)MYL3蛋白及其表達(dá)的研究主要集中在心肌組織中，發(fā)現(xiàn)MYL3主要在哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞中表達(dá)，其突變與心肌肥大有關(guān)[5-6]，臨床中已將MYL3的突變確定為家族性肥厚型心肌病的病因，并與左心室肥大有關(guān)，迄今已確定MYL3中有5個(gè)突變：M149V、R154H、E56G、A57G和E143K，均聚集在EF-hand結(jié)合區(qū)域周圍，表明該區(qū)域的正確構(gòu)象對(duì)于維持正常的心臟功能是必不可少的[7]。最新研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人類衛(wèi)星細(xì)胞在缺氧環(huán)境中培養(yǎng)時(shí)，MYL3基因表達(dá)量增加，促進(jìn)其分化成成肌細(xì)胞[8]。因此，推測(cè)MYL3基因可能是調(diào)節(jié)骨骼肌發(fā)育的候選基因。

布萊凱特黑牛是青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研成果轉(zhuǎn)化基地及教學(xué)實(shí)習(xí)基地即山東布萊凱特科技股份有限公司培育而成的優(yōu)良肉牛新種質(zhì)，2015年我國(guó)肉牛權(quán)威專家將其鑒定為新種群[9]。魯西黃牛是一個(gè)役肉兼優(yōu)的地方良種，海外譽(yù)為山東膘牛[10]。本試驗(yàn)擬通過對(duì)生長(zhǎng)性能不同的布萊凱特黑牛和魯西黃牛的背最長(zhǎng)肌和骨骼肌基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析和功能表達(dá)驗(yàn)證，為后續(xù)研究肉牛MYL3基因的生物學(xué)功能及其表達(dá)奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步為肉牛肉質(zhì)性狀的分子選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物選自青島農(nóng)業(yè)大學(xué)科研成果轉(zhuǎn)化基地及教學(xué)實(shí)習(xí)基地即山東布萊凱特黑牛科技股份有限公司。選擇飼養(yǎng)條件一致、體況相近、健康的黑牛和黃牛各12頭，分別采集黑牛和黃牛2(平均體質(zhì)量分別為66 kg/54 kg，下同)，6(214 kg/198 kg)，10(273 kg/264 kg)，12月齡(307 kg/291 kg)背最長(zhǎng)肌，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各3頭，完成采集后立即放入液氮保存；黑牛宰殺后迅速采集甲狀腺、胰腺、腎上腺等組織各2～5 g，立即放入液氮保存。

1.2 主要試劑

TRNzolTrans、DNA MarkerⅡTransSCript ONE STEP gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；iTaqUniwersal SYBR Green Supermix購(gòu)自青島溯源生物有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(2×)、轉(zhuǎn)印濾紙、TMB顯色液均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；抗體：Rabbit Anti-MYL3 antibody、Anti-beta Actin antibody；Anti-Rabbit IgG-FITC、Anti-Rabbit IgG購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司和美國(guó)Sigma公司[11]。

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

用TRIzol法從各組織中提取RNA，用全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[11]。

1.4 MYL3基因的克隆與測(cè)序及生物信息學(xué)分析

根據(jù)肉牛MYL3基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001076501.2)序列和GAPDH基因(GenBank登錄號(hào)：NM_001034034.2)的序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1，引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。以上述獲得的cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，通過T載體連接試劑盒將目的基因連接到pMD19-T載體上，反應(yīng)體系見表2，具體步驟參照pGM-T克隆試劑盒[11]；轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，搖菌，培養(yǎng)12 h后，PCR 檢測(cè)獲得陽(yáng)性克隆產(chǎn)物，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息Tab.1 The primers information

表2 連接反應(yīng)體系Tab.2 Reaction system of the connection

利用DNAMAN軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)[11]；采用MEGA 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；利用DNAStar中的Protean程序?qū)YL3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)；高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過在線網(wǎng)站(http://www.expasy.org/seissmod/swiss-mod-el.html)完成。

1.5 MYL3基因的表達(dá)分析與統(tǒng)計(jì)分析

反應(yīng)體系(20 μL)：iTaqUniwersal SYBR Green Supermix 10 μL，RNA-free Water 8 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個(gè)循環(huán)[11]。統(tǒng)計(jì)分析：采用2-ΔΔCT值法計(jì)算各樣本中MYL3相對(duì)內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)量，利用SPSS 17.0軟件t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示[11]。

1.6 熒光免疫組化

組織切片脫蠟、至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS緩沖液清洗3次，8 min/次；滴加山羊血清進(jìn)行封閉，室溫放置30 min；取出玻片，滴加一抗(兔抗山羊MYL3)1∶150，覆蓋組織片，置于4 ℃冰箱過夜。PBS緩沖液洗3次，10 min/次，滴加二抗，覆蓋組織片，置于37 ℃恒溫箱中30 min。PBS緩沖液洗3次，10 min/次；滴加DAPI染色，室溫放置5 min；利用抗熒光衰減劑封片，避光保存，熒光顯微鏡觀察并拍照分析[11]。

1.7 總蛋白質(zhì)的提取及免疫印跡檢測(cè)

將肌肉組織樣品置于預(yù)冷的研缽中，用液氮充分研磨，保持低溫，將粉末轉(zhuǎn)移到含有1.5 mL RIPA裂解液的離心管中，充分混勻置于冰上30 min，每隔10 min劇烈振蕩30 s，加入5× SDS 5 μL，懸浮振蕩20 s，3 500 r/min離心1 min。沸水處理5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清即肌肉組織總蛋白質(zhì)。將總蛋白質(zhì)用SDS-PAGE濃縮分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上進(jìn)行蛋白免疫印跡分析，加入抗體稀釋比例一抗：Myl3(1∶500)、β-actin(1∶1 000)；二抗辣根過氧化物標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(1∶2 000)，具體步驟參考文獻(xiàn)[12]。使用發(fā)光試劑盒，在暗室曝光顯影。然后掃描底片，利用Image J 1.39U對(duì)目的條帶進(jìn)行光密度值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR分析

以布萊凱特黑牛的cDNA 為模板，通過RT-PCR 克隆到一條大約645 bp的條帶，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1，目的條帶單一無拖尾，明亮清晰。經(jīng)測(cè)序得到MYL3基因，長(zhǎng)度為645 bp，與預(yù)期相符，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 MYL3生物學(xué)信息分析

生物學(xué)分析結(jié)果表明，MYL3基因CDS序列全長(zhǎng)600 bp，編碼199個(gè)氨基酸；對(duì)獲得的布萊凱特黑牛MYL3基因CDS序列與牛、瘤牛、野豬、山羊、綿羊、家犬、人、黑猩猩、家鼠和原雞GenBank中MYL3基因CDS序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表3)，除家犬(73.65%)和原雞(71.31%)外，布萊凱特黑牛與其他脊椎動(dòng)物的同源性均大于80%；采用 UPGMA 法對(duì)各物種進(jìn)行聚類分析(圖2)，結(jié)果顯示，布萊凱特黑牛與牛、瘤牛相距最近，其次與山羊、綿羊相距較近；原雞與上述動(dòng)物相距最遠(yuǎn)。

圖1 MYL3基因全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Full length cDNA amplification of MYL3

圖2 MYL3 cDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Constructed of phylogenetic tree according

2.3 MYL3基因編碼蛋白的特征分析

本研究預(yù)測(cè)分析了布萊凱特黑牛MYL3蛋白的基本性質(zhì)(表4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)的分子式為C969H1529N253O302S11，編碼199個(gè)氨基酸，其等電點(diǎn)小于5，說明是偏酸性蛋白質(zhì)；在構(gòu)成該蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，谷氨酸Glu含量最高(11.6%)，其次是丙氨酸(Ala)和賴氨酸(Lys)(均為10.1%)；不穩(wěn)定系數(shù)和脂溶性指數(shù)說明該蛋白質(zhì)的流動(dòng)性大；總平均親水性為-0.606，即水溶性蛋白質(zhì)。MYL3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖3)結(jié)果顯示，MYL3蛋白以α-螺旋(40%)和無規(guī)卷曲(30%)為主，含有少量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，其中α-螺旋的比例最高；對(duì)MYL3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

表3 布萊凱特黑牛肌球蛋白輕鏈cDNA序列與其他物種同源性比對(duì)Tab.3 Homology comparison of MYLs cDNA between Black cattle and other species %

表4 MYL3蛋白的基本性質(zhì)Tab.4 Physiochemical characters of MYL3 protein

圖3 MYL3 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Predicted secondary structure of MYL3 protein

圖4 MYL3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Predicted tertiary structure of MYL3 protein

2.4 MYL3基因的表達(dá)分析

以布萊凱特黑牛為研究對(duì)象，選擇管家基因GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照，分別對(duì)10個(gè)組織提取的總RNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)譜分析。由圖5可知，MYL3主要在心臟中表達(dá)且表達(dá)量最高(P<0.01)；其次在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)(P<0.01)；在肝臟、脾臟等其他組織中幾乎不表達(dá)，彼此之間差異不顯著(P>0.05)。研究MYL3基因在不同時(shí)期的表達(dá)規(guī)律發(fā)現(xiàn)(圖6)，MYL3在4個(gè)不同時(shí)期隨著供試牛月齡的增加基因的表達(dá)量逐漸增加，其中魯西黃牛12月齡的表達(dá)量最高，其次是10月齡，基因的表達(dá)量均極顯著高于6月齡和2月齡2個(gè)時(shí)期(P<0.01)；6月齡和2月齡MYL3的表達(dá)量逐漸降低且差異不顯著(P>0.05)。布萊凱特黑牛12月齡的表達(dá)量最高且極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.01)；2，6，10月齡表達(dá)量逐漸增加且差異不顯著(P>0.05)。同一時(shí)期不同品種間MYL3基因的表達(dá)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，布萊凱特黑牛均高于魯西黃牛，其中2，12月齡差異顯著(P<0.05)，6，10月齡差異不顯著(P>0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；相同字母或無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

Values with different small letter mean significant difference(P<0.05);And with different capital letter mean extreme differences(P<0.01);While with the same or no letter mean no significant difference (P>0.05).

圖5MYL3不同組織表達(dá)水平
Fig.5 The expression level ofMYL3gene in different organization

2.5 熒光免疫組化

如圖7，MYL3免疫反應(yīng)物質(zhì)為綠色[13]，細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)色或藍(lán)色，在本試驗(yàn)肌肉組織中，MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達(dá)，縱切呈條紋狀，橫切呈邊緣狀，由此揭示MYL3蛋白可能對(duì)肌原纖維起作用，進(jìn)而對(duì)肌肉生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

同一肉牛不同月齡間的差異用字母表示。N表示相同月齡不同肉牛間差異極顯著(P<0.01)；n表示相同月齡不同肉牛間差異顯著(P<0.05)，無字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。H和B分別代表魯西黃牛和布萊凱特黑牛。圖8同。

The difference between the different ages of the same cattle is indicated by letters. N indicates extreme differences(P<0.01)between different cattle at the same age;n indicates significant difference(P<0.05),no letter mean no significant difference (P>0.05).H and B, respectively, on behalf of the Luxi cattle and Black cattle. The same as Fig.8.

圖6MYL3基因不同時(shí)期的表達(dá)水平
Fig.6 The expression level ofMYL3gene in different periods

圖7 魯西黃牛(A，B)和布萊凱特黑牛(C，D)背最長(zhǎng)肌中MYL3蛋白的表達(dá)特征Fig.7 Expression of MYL3 protein in the longissimus dorsi muscle of Luxi cattle(A,B) and Black cattle(C,D)

A.不同時(shí)期MYL3蛋白的表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參； B.灰度分析。A.The expression of MYL3 protein in different periods was determined by β-actin as an internal reference; B.Grayscale analysis.

2.6 蛋白免疫印跡

為了進(jìn)一步研究MYL3基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，本試驗(yàn)運(yùn)用Western Blotting試驗(yàn)驗(yàn)證目的蛋白的表達(dá)，得到2條大小約為21 ku的目的蛋白條帶：圖8-A中MYL3(B)、(H)；得到2條大小約為42 ku的內(nèi)參蛋白條帶：圖8-A中β-actin(B)、(H)。結(jié)果表明，MYL3蛋白抗體具有良好特異性，且該蛋白在肌肉組織的各時(shí)期均有表達(dá)，但表達(dá)量不同。進(jìn)一步對(duì)蛋白免疫印跡結(jié)果進(jìn)行灰度分析(圖8-B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12月齡MYL3蛋白表達(dá)量最高，極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.01)；其次是10月齡和6月齡；2月齡MYL3蛋白的表達(dá)量最低，差異不顯著(P>0.05)，MYL3蛋白的表達(dá)量隨著供試牛月齡增加逐漸增加。4個(gè)時(shí)期黑牛肌肉組織中MYL3蛋白表達(dá)量除10月齡，其余3個(gè)時(shí)期表達(dá)量均高于魯西黃牛，其中2，12月齡表達(dá)量差異顯著(P<0.05)，6，10月齡差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

3.1 肌球蛋白輕鏈3基因克隆與分析

本研究利用普通PCR法克隆了布萊凱特黑牛的MYL3基因序列，結(jié)果顯示，MYL3基因CDS序列全長(zhǎng)為600 bp，編碼199個(gè)氨基酸。同源性分析顯示，MYL3序列具有較高的同源性，其中布萊凱特黑牛MYL3序列與牛、瘤牛、野豬、山羊、綿羊、人均大于80%，說明該基因CDS序列在脊椎動(dòng)物中具有高度保守性，與“重要功能蛋白氨基酸置換率較低”理論相一致[14]。生物學(xué)信息分析顯示，MYL3蛋白分子式為C969H1529N253O302S11，等電點(diǎn)小于5，屬于偏酸性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)大于40，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差；蛋白質(zhì)的總平均親水性為-0.606，非極性氨基酸含量較高，表現(xiàn)親水性；二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，α-螺旋和無規(guī)卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，含有少量的β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，易于形成球狀蛋白，屬于all-alpha型，蛋白質(zhì)的水溶性較好，這與上述預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)基本性質(zhì)中的總平均親水性相一致。這些特征與其他物種MYL3序列的特征結(jié)構(gòu)均相似[15]。MYL3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)均由一條多肽鏈構(gòu)成，結(jié)構(gòu)呈桶狀，屬于球狀蛋白，說明該基因編碼蛋白質(zhì)保守性較強(qiáng)，符合“多基因家族的協(xié)同進(jìn)化”理論[16]，與上述同源性比對(duì)中揭示的物種進(jìn)化關(guān)系相一致。

3.2 MYL3基因相對(duì)定量表達(dá)分析

早期研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白輕鏈3基因僅在快肌中表達(dá)，含有α(MYH6)和β(MYH7)2個(gè)不同的亞型，2種亞型的差異表達(dá)可以最大限度地調(diào)節(jié)肌肉的收縮功能[2]。Sherwood等[17]研究發(fā)現(xiàn)，MYL3C-末端絲氨酸殘基的磷酸化對(duì)心臟收縮具有重要意義，綜上認(rèn)為MYL3可能參與肌肉發(fā)育和神經(jīng)調(diào)節(jié)肌肉收縮的相關(guān)過程。本試驗(yàn)研究MYL3基因在不同組織的表達(dá)規(guī)律時(shí)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MYL3主要在心臟中表達(dá)，其次在背最長(zhǎng)肌中表達(dá)，肝臟、脾臟等其他組織中則幾乎不表達(dá)，這與在羊上的研究結(jié)果一致[8]。Komurcu-Bayrak等[7]使用Northern印跡法研究發(fā)現(xiàn)，成年小鼠的MYL3主要在心肌表達(dá)，其表達(dá)量高于骨骼肌，而在其他組織中則幾乎不表達(dá)，這與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。綜上研究表明，MYL3基因在骨骼肌中表達(dá)水平僅次于心肌，由此推測(cè)MYL3可能在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和肌肉收縮過程中發(fā)揮重要的作用。

Koning等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在低氧環(huán)境人的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化時(shí)，MYL3基因表達(dá)量上調(diào)會(huì)促進(jìn)肌源性干細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成成肌細(xì)胞。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，2種肉牛MYL3在4個(gè)不同時(shí)期肌肉組織中其表達(dá)量隨著月齡的增加逐漸增加，這與豬上的研究結(jié)果一致[18]。MYL3表達(dá)量結(jié)合肉牛體質(zhì)量增長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，MYL3表達(dá)量隨著月齡增加的同時(shí)，肉牛體質(zhì)量也在增長(zhǎng)，顧志良等[19]研究發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白輕鏈1(MYL1)在鵝胚胎期肌肉發(fā)育過程中起重要作用，MYL1包括MLC1f和MLC1v共2種異構(gòu)體，在小鼠肌肉的發(fā)育階段，2種異構(gòu)體的表達(dá)是相互獨(dú)立的，即在發(fā)育不同階段出現(xiàn)，MLC1f是從胚胎骨骼肌的分化時(shí)期開始積累，MLC1v從胚胎骨骼肌發(fā)育時(shí)期開始大量積累[2]。依上述研究結(jié)果推測(cè)，MYL3基因在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育過程中積累并發(fā)揮作用，推測(cè)其能夠促進(jìn)骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)4個(gè)時(shí)期黑牛和黃牛肌肉組織中MYL3基因的表達(dá)量存在差異，黑牛高于黃牛，這可能與肉牛的品種、個(gè)體的飼養(yǎng)環(huán)境以及機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育差異有關(guān)，具體關(guān)聯(lián)分析有待進(jìn)一步研究。

3.3 MYL3蛋白表達(dá)分析

采用免疫組織化學(xué)的方法研究MYL3蛋白的表達(dá)定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達(dá)，謝遇春[20]研究發(fā)現(xiàn)， MYL3 蛋白可能定位于Ⅰ型即氧化性肌纖維上，Wolf Psort預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)的可能性最大，這與本試驗(yàn)MYL3蛋白主要定位于細(xì)胞肌漿肌原纖維粗肌絲的結(jié)果一致[3]，同時(shí)可以印證“肌球蛋白具有ATP的結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)成肌原纖維粗肌絲的主干”這一觀點(diǎn)[21]。本試驗(yàn)魯西黃牛中MYL3蛋白表達(dá)的熒光的數(shù)量要多于布萊凱特黑牛，說明MYL3蛋白在粗肌絲中發(fā)揮作用，不同物種中其表達(dá)量不同。

為了進(jìn)一步研究MYL3蛋白的表達(dá)水平，本試驗(yàn)運(yùn)用Western Blotting試驗(yàn)獲得該蛋白質(zhì)不同時(shí)期肌肉組織的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白在肌肉組織的各時(shí)期均有表達(dá)且表達(dá)量不同?；叶确治霭l(fā)現(xiàn)，2種牛MYL3蛋白在4個(gè)不同時(shí)期表達(dá)趨勢(shì)相似，均隨月齡的增加逐漸增加，其中12月齡MYL3蛋白的表達(dá)量最高，極顯著高于其他3個(gè)時(shí)期(P<0.01)；2月齡MYL3蛋白的表達(dá)量最低，本研究與上述熒光定量mRNA的表達(dá)水平結(jié)果相一致，與MYL3表達(dá)可能對(duì)綿羊骨骼肌的生長(zhǎng)沒有影響的結(jié)果相駁[21]，可能與試驗(yàn)動(dòng)物種類不同有關(guān)，但與豬上的研究結(jié)果一致[22]。Lee等[23]在雞中檢測(cè)到肌球蛋白基因在胚胎期持續(xù)表達(dá)，且在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過程中不同階段表達(dá)的肌球蛋白亞型不同，表明MYL3蛋白在骨骼肌中發(fā)揮作用。本試驗(yàn)中供試牛各生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期MYL3蛋白的表達(dá)量差異顯著，結(jié)合肉牛體質(zhì)量增長(zhǎng)曲線分析顯示，肉牛體質(zhì)量增加的同時(shí)MYL3蛋白的表達(dá)量也增加，Ling 等[24]鑒定了豬MYL1基因mRNA 5 個(gè)選擇性剪切體(MLC1f、MLC1v、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C)發(fā)現(xiàn)，除了剪切體MLC1f外，其余剪切體基因的表達(dá)量均隨豬個(gè)體體質(zhì)量的增加而逐步增加，到豬成年時(shí)其表達(dá)量迅速增至最高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，因此，推測(cè)MYL3基因參與骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的調(diào)節(jié)，并在此過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

克隆獲得黑牛MYL3基因CDS序列全長(zhǎng)，編碼199個(gè)氨基酸，分析發(fā)現(xiàn)其與瘤牛、野豬、山羊親緣關(guān)近，同源性高；不同時(shí)期MYL3基因的表達(dá)量在肌肉組織中隨月齡的增加逐漸增加；MYL3蛋白主要在肌原纖維的粗肌絲中表達(dá)，不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期蛋白質(zhì)的表達(dá)量隨月齡的增加而增加，推測(cè)MYL3基因與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，可能參與促進(jìn)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)過程。