OmpR對傷寒沙門菌侵襲上皮細胞能力的影響

林立萍，張連璐，易周易，趙雅聞，李雪，唐浩，黃新祥，張盈

（江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi）是一種革蘭陰性兼性胞內(nèi)寄生兼性厭氧菌，感染機體后可以引起胃腸炎或傷寒［1］。S.Typhi感染過程分為兩個階段：細菌黏附并侵入小腸上皮細胞，為腸道感染階段；細菌進入上皮細胞或巨噬細胞內(nèi)，然后在胞內(nèi)復制，為細胞內(nèi)感染階段［2-3］。該過程所需的相關(guān)基因位于沙門菌致病島（salmonella pathogenicity island，SPI）。S.Typhi表達兩個不同的Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS），能在感染后將效應蛋白注入宿主細胞：一個是SPI-1，其效應蛋白與細菌和宿主細胞的黏附有關(guān)，可引起腸黏膜細胞的肌動蛋白發(fā)生重排，有利于S.Typhi內(nèi)化［4］，能夠促進沙門菌進入和侵襲上皮細胞。另一個是SPI-2，其在吞噬細胞內(nèi)具有活性，且為吞噬體生存所必需。以往研究表明［5］，EnvZ／OmpR雙組分系統(tǒng)參與SPI-1基因表達的調(diào)控，OmpR-P能夠直接與hilC和hilD啟動子結(jié)合，激活前者并且抑制后者基因的表達，從而影響S.Typhi對上皮細胞的侵襲力。本研究利用ompR缺陷株（ΔompR），分析OmpR對S.Typhi侵襲上皮細胞能力的影響，并進一步選擇SPI-1中3個操縱子首基因iagA、invF、prgH，研究其相關(guān)分子機制以探討OmpR在S.Typhi侵襲過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

S.Typhi野生株GIFU10007（WT）為日本岐阜大學醫(yī)學院微生物學教研室饋贈。S.Typhi的ΔompR菌株由本實驗室制備及保存［6］。大腸埃希菌DH5α由本實驗室保存。HeLa細胞購自上海生科院細胞庫。

胰蛋白胨、酵母提取物、氯霉素、胰蛋白酶、胎牛血清（英國Oxoid公司）；無水乙醇、異丙醇（上海國藥集團化學試劑有限公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；SYBR熒光定量試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA酶Ⅰ快速DNA消化試劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DL 2000 DNA標準參照物（大連TaKaRa公司）；凝膠阻滯實驗（EMSA）上樣緩沖液（碧云天生物技術(shù)有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）；細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

2720型PCR儀（美國ABI公司）；核酸紫外檢測儀（Eppendorf公司）；熒光定量PCR儀（美國Biorad公司）；凝膠成像系統(tǒng)（基因有限公司）；電轉(zhuǎn)化儀（美國Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機，CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物 實驗中所用引物由蘇州泓訊生物科技有限公司合成，序列見表1（下劃線示酶切位點）。

表1 引物名稱及相應序列

1.2.2 ompR基因缺失回補株的制備 以WT基因組DNA作為模板，以ompR-C-F／R為引物進行PCR擴增，并純化回收；利用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和Hin dⅢ對上述PCR產(chǎn)物和載體pBAD33質(zhì)粒純化產(chǎn)物分別行酶切處理，用DNA連接酶進行連接；連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，用含氯霉素的LB平板進行篩選，挑取轉(zhuǎn)化后的單菌落過夜培養(yǎng)，苯酚和氯仿抽提各菌落基因組行電泳鑒定，初步篩選陽性克隆。提取所篩選的質(zhì)粒，以內(nèi)部引物對ompR-C-F和ompR-C-R、交叉引物對ompR-C-F和pBAD33-R分別進行PCR擴增，進一步驗證陽性質(zhì)粒是否連接目的片段。經(jīng)PCR驗證正確后，經(jīng)基因序列分析（由蘇州泓訊生物科技有限公司完成）驗證。提取序列正確的重組質(zhì)粒（ompRpBAD33），并將其電轉(zhuǎn)入ΔompR中，即可得ompR基因缺失回補株（記為C-ΔompR）。同時將空載體pBAD33轉(zhuǎn)入WT和ΔompR中作為相應的對照株（分別記為WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33）。

1.2.3 HeLa細胞侵襲實驗 用含10%胎牛血清的DMEM于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)HeLa細胞，在實驗前1 d將細胞以1×105／mL密度接種于24孔中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33和C-ΔompR于20 mL LB培養(yǎng)基中，250 r／min，37℃培養(yǎng)至對數(shù)早期［D（600 nm）＝0.4］。按照MOI為20∶1的比例向細胞中加入細菌，孵育90 min；棄上清液，PBS洗3次。一半孔內(nèi)加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解細胞，孵育12 min后涂于LB平板，培養(yǎng)過夜，其克隆數(shù)代表黏附水平（以T0表示）；余下一半孔內(nèi)加入100 μg／mL慶大霉素殺死胞外菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min后同樣加入0.5%（v／v）Triton X-100裂解細胞，過夜培養(yǎng)，計算單克隆數(shù)代表侵襲水平（以T90表示）；重復3次后進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 熒光實時定量PCR（qRT-PCR）檢測侵襲相關(guān)基因的mRNA表達水平 選擇SPI-1中3種侵襲相關(guān)基因iagA、invF、prgH行qRT-PCR分析。將WT-pBAD33、ΔompR-pBAD33單菌落分別接種于2 mL LB培養(yǎng)基，37℃、250 r／min振蕩培養(yǎng)過夜。次日，將種子液以1∶100比例轉(zhuǎn)接至20 mL LB，相同條件培養(yǎng)至穩(wěn)態(tài)期［D（600 nm）＝2.0］。將培養(yǎng)的WT-pBAD33和ΔompR-pBAD33于4℃行4 000 r／min離心收集沉淀。Trizol法提取細菌總RNA，使用DNA酶ⅠDNA消化試劑盒消化基因組DNA。取1 μg總RNA，以特異性下游引物和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板，用上下游引物進行擴增，采用兩步法qRT-PCR（95℃預變性150 s，95℃10 s，65℃30 s，40個循環(huán)），其中16 SrRNA為內(nèi)參基因（引物見表1），觀察相關(guān)基因在各菌株中的轉(zhuǎn)錄水平。實驗重復3次；Bio-Rad CFX Manager軟件整理和分析數(shù)據(jù)，利用相對定量法確定mRNA的相對表達水平。

1.2.5 EMSA 以WT基因組DNA為模板，PCR擴增iagA、invF、prgH基因啟動子區(qū)序列并純化，16 S DNA用作陰性對照（引物見表1）。在結(jié)合緩沖液中加入20 mmol／L新鮮乙酰磷酸鹽，并與純化的His-OmpR蛋白一起室溫放置10 min以實現(xiàn)OmpR磷酸化；結(jié)合體系配制完成后，分別加入1μL DNA片段于30℃溫育30 min；產(chǎn)物行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后用溴化乙啶染色，于凝膠成像儀顯影后分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 C-△ompR制備

2.1.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 PCR擴增獲得752 bp ompR目的片段（圖1a）。以內(nèi)部引物對和交叉引物對進行PCR擴增篩選陽性克隆，相應擴增片段長度與理論值（分別為752 bp和802 bp）一致（圖1b）；挑取PCR鑒定正確的克隆經(jīng)基因序列分析驗證，該質(zhì)粒所連接的目的片段不存在缺失、插入等突變，表明重組載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.2 C-△ompR的驗證 以C-ΔompR基因組為模板的擴增片段與理論值（分別為802 bp、874 bp和924 bp）一致；而以雙蒸水為模板均擴增不出條帶，表明陽性重組質(zhì)粒成功導入ΔompR中，回補株制備成功。見圖2。

圖2 回補株P(guān)CR鑒定凝膠電泳圖

2.2 OmpR增強S.Typhi侵襲上皮細胞的能力

如圖3所示，與WT-pBAD33相比，ΔompRpBAD33對HeLa細胞的侵襲能力顯著下降，而CΔompR侵襲能力較ΔompR-pBAD33明顯升高（P均＜0.01），說明OmpR可促進S.Typhi對上皮細胞的侵襲。

2.3 OmpR增加侵襲相關(guān)基因的表達

qRT-PCR結(jié)果顯示，ΔompR-pBAD33中侵襲相關(guān)基因iagA、invF、prgH的轉(zhuǎn)錄水平較WT-pBAD33明顯降低（P均＜0.01，圖4）。由此表明，OmpR正向調(diào)控S.Typhi侵襲上皮細胞相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。

圖3 ompR缺陷對S.Typhi侵襲上皮細胞能力的影響

圖4 OmpR對侵襲相關(guān)基因表達的影響

2.4 OmpR直接和prgH啟動子區(qū)域結(jié)合

EMSA結(jié)果顯示（圖5），His-OmpR以劑量依賴性方式與prgH的啟動子區(qū)域結(jié)合，但其與iagA和invF基因啟動子區(qū)域以及陰性對照16 SDNA未有結(jié)合。

圖5 Omp R直接和prgH啟動子區(qū)域結(jié)合

3 討論

S.Typhi是一種原核生物，可引起人類全身系統(tǒng)性感染——傷寒熱［7］。S.Typhi感染機體引起疾病的過程很大程度上依賴于其通過污染的食物和水經(jīng)消化道感染宿主，進入宿主后侵入腸上皮細胞并在巨噬細胞內(nèi)存活的能力［8］。S.Typhi的致病能力與多種侵襲、菌毛、鞭毛基因以及調(diào)節(jié)因子等相關(guān)，其中影響入侵過程的主要毒力因子由SPI-1編碼。

OmpR是雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)EnvZ／OmpR的調(diào)節(jié)蛋白，是一種中央調(diào)節(jié)因子，其經(jīng)傳感器激酶EnvZ磷酸化激活，由此產(chǎn)生的OmpR-P調(diào)節(jié)許多具有不同細胞途徑的基因［9］，如外膜孔蛋白、鞭毛基因、菌毛以及Vi抗原。以往研究表明［6，10-11］，在SPI-1編碼的4種AraC樣轉(zhuǎn)錄因子HilA，HilC，HilD和InvF中，OmpR-P能夠直接與hilC和hilD啟動子結(jié)合，激活前者并且抑制后者，HilC和HilD控制自身與其轉(zhuǎn)錄，并一起激活hilA轉(zhuǎn)錄，HilA進一步激活invF的轉(zhuǎn)錄，從而影響S.Typhi對上皮細胞的侵襲力。本文以ompR基因作為研究對象，構(gòu)建了回補株CΔompR，對OmpR在S.Typhi侵襲上皮細胞中的功能進行研究，發(fā)現(xiàn)ompR的缺失能顯著降低S.Typhi對HeLa細胞的侵襲能力，而C-ΔompR侵襲能力只是部分恢復，可能與回補基因的表達量有關(guān)。

SPI-1中含有inv、hil、org、spt、sip、iag、iae、prg等基因［12］，編碼T3SS的各種成分，其中T3SS分泌裝置注射體的子結(jié)構(gòu)主要由3種完整的膜蛋白InvG，PrgH和PrgK組成［13］，它們通過形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)從而分泌各種成分。本實驗選擇SPI-1中3個操縱子首基因iagA、invF、prgH，通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)OmpR可促進這些侵襲相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。進一步采用EMSA，通過在純化的His-OmpR蛋白中加入新鮮乙酰磷酸鹽，實現(xiàn)OmpR的體外磷酸化。結(jié)果顯示，OmpR-P可直接與prgH基因啟動子區(qū)域結(jié)合，與iagA和invF基因啟動子區(qū)域未有結(jié)合。PrgH是T3SS分泌裝置注射體的組成部分，參與T3SS基座內(nèi)環(huán)的構(gòu)成。本研究結(jié)果表明OmpR可直接調(diào)節(jié)T3SS結(jié)構(gòu)相關(guān)基因的表達。

綜上所述，OmpR能夠通過直接調(diào)節(jié)prgH和間接調(diào)節(jié)iagA、invF增加侵襲相關(guān)基因的表達，從而增強S.Typhi對上皮細胞的侵襲力。然而，本研究結(jié)果雖表明prgH是OmpR的靶基因，但是OmpR與prgH的結(jié)合位點仍需進一步確定。