交叉引物擴(kuò)增法檢測食品中大腸桿菌不耐熱腸毒素的研究

劉文鑫，袁超文，張力國，馮瑜菲

（1.湛江中心人民醫(yī)院，廣東湛江524045；2.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，遼寧沈陽110169；3.遼寧省重大動(dòng)物疫情應(yīng)急中心，遼寧沈陽110161；4.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江524001）

隨著我國食品工業(yè)的快速發(fā)展，由食源性致病菌引起的食物中毒和食源性疾病爆發(fā)頻率呈上升趨勢，不僅危害人類的健康和生命，也對公共衛(wèi)生事業(yè)和國家經(jīng)濟(jì)造成嚴(yán)重?fù)p失[1]。我國衛(wèi)生部提供統(tǒng)計(jì)資料顯示，2015年共爆發(fā)地區(qū)性食源性疾病總數(shù)為169 起，患病5 926 人，死亡121 人，其中微生物性食物中毒人數(shù)最多，占全年食物中毒總?cè)藬?shù)的53.7%。食源性病原微生物可通過食物鏈的任何一個(gè)環(huán)節(jié)隨著污染的食物和水進(jìn)入機(jī)體，現(xiàn)已確認(rèn)有超過30 多種病原菌可以引發(fā)食源性疾病，常見的食源性致病菌包括腸出血性大腸桿菌 （enterohemorrhagicEscherichia coli，EHEC）、沙門氏菌（Salmonella spp）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（enterotoxigenicEscherichia coli，ETEC）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等[2]。ETEC 被視為引起人類腹瀉的主要病原之一，在全球范圍內(nèi)，每年可導(dǎo)致數(shù)億人發(fā)生腹瀉，尤其是發(fā)展中國家的嬰幼兒和兒童。同時(shí)也是引起旅行者腹瀉的主要原因[3]。ETEC 產(chǎn)生的細(xì)菌定植因子（clonization factor，CF）和腸毒素是關(guān)鍵的毒力因子，首先CF 特異性黏附到小腸粘膜上皮細(xì)胞表面的受體，隨后菌體大量合成并分泌耐熱腸毒素（heat-stable enterotoxin，ST）或不耐熱腸毒素（heat-labile enterotoxin，LT）刺激腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP），致使細(xì)胞內(nèi)液體及電解質(zhì)流失引起人或動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重腹瀉[4-5]。隨著我國食源性疾病爆發(fā)率不斷上升，在食品污染所引發(fā)的腸道疾病中，LT 仍是不可忽略的重要因素之一[6]，因此，快速、靈敏地檢測食品中的LT 毒力基因已成為控制食品安全問題的關(guān)鍵。

目前對于不耐熱腸毒素毒力基因的檢測方法歸納起來可分為傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)和分子檢測技術(shù)，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測技術(shù)操作較為耗時(shí)、繁瑣、檢測靈敏度也較低，在應(yīng)對突發(fā)性食品安全公共事件上，不能滿足快速、準(zhǔn)確、高靈敏和特異性等要求[7]。分子檢測技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（polymerase chain reaction，PCR）、DNA 探針技術(shù)、生物芯片技術(shù)和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等，這些技術(shù)具有快速，特異，敏感和節(jié)約時(shí)間以及勞動(dòng)成本的特點(diǎn)而被廣泛使用。交叉引物等溫?cái)U(kuò)增（cross priming amplification，CPA）技術(shù)是近年來被廣泛應(yīng)用的一種新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，利用5 條特異性引物和具有鏈置換活性的Bst-DNA 聚合酶在等溫條件下對靶基因不斷地進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增[8]。與傳統(tǒng)的PCR 方法相比，CPA 技術(shù)不僅擺脫了對昂貴儀器設(shè)備的依賴，降低檢測成本，同時(shí)因具有較高的特異性和敏感性，極大程度地提高了檢測效率，縮短檢測時(shí)間[9]。該方法被視為繼環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）之后的又一項(xiàng)被廣泛用于科學(xué)研究、疾病診斷和食品微生物檢測等領(lǐng)域的新型核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10]。

本研究以LT 保守序列作為靶基因設(shè)計(jì)CPA 特異性引物，并與LAMP 和熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qPCR）方法進(jìn)行對比，以期為不耐熱腸毒素基因的診斷提供一種快速、靈敏、肉眼即可判斷的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑與樣本

Trans 2k plus II DNA Marker、脫氧核糖核苷三磷酸 （deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）、MgCl2、DNA 提取試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；甜菜堿：Sigma 上海貿(mào)易有限公司；瓊脂糖：北京沃比森科技有限公司；SYBR Green I 染料：北京索萊寶科技有限公司；Bst-DNA 聚合酶大片段：NEB（北京）有限公司；華峰管：廣州華峰生物科技有限公司；本研究所用引物均由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

46 份生豬肉樣品購自當(dāng)?shù)厥袌?，?jīng)鑒定均不含不耐熱腸毒素大腸桿菌。

1.1.2 菌種來源

大腸桿菌參考菌株C83903（LT+）、C83920（Sta+）、C44498（Stx2e+）和O157：H7：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌ATCC 43886（LT+）、產(chǎn)氣莢膜梭菌ATCC 13124、嗜水氣單胞菌ATCC 7966、腸炎沙門氏菌ATCC 13076、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、金黃色葡萄球菌ATCC 29213、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715、副溶血性弧菌ATCC 27519、大腸桿菌OS-13（Stb+）均為東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院保存。

1.2 儀器與設(shè)備

電泳儀（DYY-2）、電泳槽（DCY-31D）：北京六一儀器廠；生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Z）：上海博迅實(shí)業(yè)公司；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon 2500R）：上海天能科技有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16.5）：上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋（歐萊博H-W420）：山東博科科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

以不耐熱腸毒素家族A 亞基保守序列（GenBank登錄號(hào)為JX504011.1）為靶基因，應(yīng)用在線軟件Primer-Explorer V4 設(shè)計(jì)CPA 特異性引物，Real-time PCR 和LAMP 引物序列見表1。

表1 CPA、LAMP和熒光定量PCR擴(kuò)增引物Table 1 Primers of CPA，LAMP and qPCR assays

1.3.2 模板的制備

將C83903（LT+）菌株接種于麥康凱瓊脂平板37 ℃倒置培養(yǎng)16 h～24 h。然后挑取單個(gè)菌落接種于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃200 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)。取5 mL 培養(yǎng)物，經(jīng)10 000 r/min 離心3 min，取上清液作為DNA模板，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 生豬肉人工隨機(jī)污染

將C83903（LT+）菌株接種于新鮮無菌的麥康凱培養(yǎng)基中于37 ℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行1 000 倍稀釋，隨后將稀釋后的菌液隨機(jī)污染不含LT 毒素的生豬肉樣品勻漿液中。10 000 r/min 離心3 min，棄去上清液，用1 mL 0.9%生理鹽水懸浮菌體，作為產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌人工污染樣本，并做好記錄。

1.3.3 反應(yīng)條件優(yōu)化

首先對CPA 的特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證，25 μL 反應(yīng)體系中含有2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl22 μL、10×Thermopol Buffer 2.5μL、0.8 mol/L Betaine 2 μL 、8 U/管Bst-DNA 聚合酶大片段，1s 5 μL，2a/3a各2 μL，4s/5a 各1 μL，以上引物濃度均為10 μmol/L，并在60 ℃恒溫條件下作用60 min。反應(yīng)結(jié)束后于80 ℃條件下加熱5 min 以終止反應(yīng)。隨后將華峰管內(nèi)反應(yīng)產(chǎn)物與預(yù)先加入的1 μL（2 000×）SYBR Green I 染料混勻后分別于自然光和紫外下觀察，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進(jìn)行分析。

為確定CPA 最佳的反應(yīng)溫度、dNTPs 濃度、Bst 聚合酶濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)反應(yīng)均重復(fù)3 次，反應(yīng)體系構(gòu)成與步驟同上。分別改變反應(yīng)溫度（60、62、64、66、68、70 ℃）、dNTPs 濃度（0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）、Bst 酶濃度 （6、8、10、12 U/管）、Mg2+濃度（1.0、2.0、3.0 mmol/L）、甜菜堿濃度（0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L）以及反應(yīng)時(shí)間（15、30、45、60、75、90 min），反應(yīng)產(chǎn)結(jié)束后熱終止反應(yīng)，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

1.4 特異性檢測

本研究共使用14 株試驗(yàn)菌（6 株大腸桿菌和8 株非大腸桿菌）對CPA 進(jìn)行特異性檢測，同時(shí)設(shè)定不添加模板的陰性對照并與LAMP 法進(jìn)行比較。反應(yīng)結(jié)束后將另一側(cè)預(yù)先滴加的SYBR Green I 熒光染料與擴(kuò)增產(chǎn)物緩慢混勻并于自然光和紫外燈下觀察，并用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物分析。

1.5 敏感性檢測

將C83903（LT+）菌株過夜培養(yǎng)后的新鮮菌液作為模板，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，調(diào)整初始菌液濃度至8×106cfu/mL，10 倍倍比稀釋至8×101cfu/mL，隨后繼續(xù)稀釋至濃度為40、20、10 cfu/mL 共9 個(gè)稀釋度；分別吸取2 μL 稀釋后的菌液作為模板進(jìn)行CPA 敏感性擴(kuò)增試驗(yàn)，同時(shí)與LAMP 和qPCR 擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較。

1.6 人工污染生豬肉樣本的檢測

分別應(yīng)用CPA、LAMP 和qPCR3 種方法對46 份經(jīng)產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌人工隨機(jī)污染的生豬肉樣本進(jìn)行檢測，用DNA 提取試劑盒對生豬肉樣本進(jìn)行處理并提取DNA 基因組作為模板，CPA 和LAMP 的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳作用后，并與qPCR 反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 檢測方法的建立與優(yōu)化

本研究應(yīng)用的CPA 引物具有良好的特異性，可在60 min 內(nèi)60 ℃條件下完成對LT 毒素基因的大量擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖電泳后，陽性產(chǎn)物呈不規(guī)則梯形條帶，而陰性對照無條帶。CPA 擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

圖1 CPA擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result from CPA amplification

將華峰管內(nèi)另一側(cè)的SYBR Green I 染料與反應(yīng)產(chǎn)物緩慢混勻后，肉眼觀察陽性管內(nèi)呈現(xiàn)綠色，陰性呈淡橙色；紫外燈下觀察，陽性管內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光，而陰性管顏色無變化。

LAMP 和CPA 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果見圖2。

圖2 LAMP和CPA反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.2 Optimization for CPA amplified condition

本研究對CPA 的反應(yīng)溫度、Bst 聚合酶濃度、dNTPs 濃度、Mg2+濃度、甜菜堿濃度和擴(kuò)增時(shí)間分別進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果可見在62、64 ℃和66 ℃條件下均可產(chǎn)生梯狀條帶，故選擇62 ℃為最優(yōu)擴(kuò)增溫度；使用8 U/管Bst 聚合酶濃度擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生梯狀條帶最清晰，故選擇8 U/管為最優(yōu)濃度；dNTPs 濃度為0.3 mmol/L 擴(kuò)增產(chǎn)生的條件最清晰；隨著反應(yīng)的進(jìn)行，于45 min 時(shí)出現(xiàn)清晰明亮的梯形條帶，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加條帶亮度變化不明顯，故選擇45 min 為最優(yōu)擴(kuò)增時(shí)間。根據(jù)以上原則CPA 反應(yīng)的Mg2+濃度和甜菜堿濃度最優(yōu)值分別為2.0 mmol/L 和0.8 mol/L。

2.2 特異性試驗(yàn)

LAMP 和CPA 特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

用上述優(yōu)化的CPA 方法分別對14 株不同菌株進(jìn)行特異性檢測，且重復(fù)3 次。瓊脂糖電泳結(jié)果表明，CPA 法檢測出攜帶大腸桿菌LI+基因菌株2 株，其他12 株為非攜帶LI+基因菌株，與LAMP 檢測結(jié)果一致，說明建立的CPA 法具有高特異性。

2.3 敏感性試驗(yàn)

LAMP 和CPA 敏感性試驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖3 特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of the reactions

圖4 敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of the reactions

將過夜培養(yǎng)的純菌液濃10 倍稀釋至8×101cfu/mL，隨后稀釋40、20 cfu/mL 和10 cfu/mL 共9 個(gè)稀釋度進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 次。瓊脂糖電泳結(jié)果如圖4所示，CPA 法與qPCR 法具有相同的檢測靈敏度為40 cfu/mL，而LAMP 法靈敏度為8×101cfu/mL，可見CPA 法的檢測靈敏度較LAMP 法高2 倍。

2.4 人工污染生豬肉樣本檢測結(jié)果

分別應(yīng)用CPA 法和LAMP 法對46 份隨機(jī)污染的生豬肉樣本進(jìn)行快速檢測，以qPCR 結(jié)果作為參考。結(jié)果可見，CPA 和LAMP 方法共檢測出攜帶LT 陽性基因7 株，與qPCR 法檢測結(jié)果一致，且檢出率均為15.2%。

表2 臨床樣本檢測結(jié)果Table 2 The detection results of clinical samples

3 結(jié)論與討論

本研究成功設(shè)計(jì)出針對食源性大腸桿菌不耐熱腸毒素全基因保守序列的CPA 特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、Bst 酶濃度、dNTPs 濃度等參數(shù)，建立了一種快速、特異、敏感的新型檢測方法。建立的CPA 法與LAMP 方法相比，二者均具有較高的特異性，從加樣到反應(yīng)結(jié)束整個(gè)過程僅需要1.5 h 即可完成對目的基因的特異性擴(kuò)增，并對非攜帶目的基因菌株檢測呈陰性。敏感性試驗(yàn)結(jié)果可見，與之前報(bào)道的LAMP 方法相比[11]，CPA 等溫?cái)U(kuò)增法和熒光定量PCR 方法具有相同的靈敏度，且較LAMP 法高出2 倍，僅為40 cfu/mL，可滿足低拷貝目的基因的檢測。本研究應(yīng)用人工污染生豬肉方法模擬食品抽樣檢驗(yàn)，以熒光定量PCR 結(jié)果作為參照，CPA 和LAMP 方法對人工污染生豬肉的陽性檢出率均為15.2%（7/46），說明CPA 作為一種新型的等溫檢測技術(shù)，能夠滿足食品衛(wèi)生行業(yè)定性檢驗(yàn)微生物學(xué)的要求。

在CPA 擴(kuò)增過程中，隨著體系內(nèi)DNA 的不斷合成會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸鎂沉淀，可根據(jù)是否生成白色沉淀判斷反應(yīng)結(jié)果，但本研究對LT 毒素基因擴(kuò)增時(shí)，并未發(fā)現(xiàn)管內(nèi)產(chǎn)生肉眼明顯可見的白色沉淀，只觀察到管內(nèi)液體為混濁，通過濃度為2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析可見不同大小的區(qū)帶階梯式圖譜。同時(shí)，為避免在開蓋時(shí)反應(yīng)體系產(chǎn)生的大量氣溶膠污染周圍環(huán)境，本研究選擇廣州華峰生物科技有限公司生產(chǎn)的華峰管進(jìn)行可視化檢測，反應(yīng)前分別將SYBR Green I 染料和反應(yīng)體系混合物加入華峰管兩側(cè)，反應(yīng)結(jié)束后將二者混合即可判斷反應(yīng)結(jié)果，有效地防止氣溶膠造成的交叉污染。

綜上所述，本研究所建立的CPA 快速檢測產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的等溫?cái)U(kuò)增方法，不僅具有時(shí)間短、低成本、高特異性和高特異性的特點(diǎn)，而且不需要依賴特殊的、精密昂貴的儀器設(shè)備和嚴(yán)格的試驗(yàn)條件，為食源性致病菌檢測提供了新的解決思路，在感染性疾病診斷和食品衛(wèi)生檢驗(yàn)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。