響應面法優(yōu)化插田泡花色苷超聲輔助提取工藝

蔣華梅，王向前

（1.貴陽學院化學與材料工程學院，貴州貴陽550005；2.貴陽學院圖書館，貴州貴陽550005）

插田泡是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus）植物，果實6月～8月成熟，富含VC、蛋白質、超氧化物歧化酶、花色苷等成分，營養(yǎng)十分豐富[1-2]?；ㄉ諏冱S酮多酚類物質，具有抗炎、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、改善胰島素抵抗、調節(jié)血脂及預防心肌缺損等生物活性和多種保鍵功能[3-5]，還可作為食用色素和功能食品原料使用，具有較高的經濟價值。近年來，國內外研究人員對懸鉤子屬類植物，如黑莓、樹莓、紅樹莓果實中花色苷的提取純化及鑒定、抗氧化活性、抑菌、抗腫瘤方面進行了大量的研究[6-19]。懸鉤子屬植物插田泡（Rubus coreanusMaq.）果實花色苷的研究僅涉及酸化乙醇溶劑振蕩提取及粗提物抗氧化活性方面的報道[1]。關于插田泡果實花色苷提取方法及工藝的優(yōu)化研究還不夠系統(tǒng)和全面。

植物花色苷的提取方法有溶劑法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法、超臨界流體萃取法[3，19-21]等。溶劑浸提法，設備簡單、投資少、耗時費事。超聲輔助提取法是利用超聲波輻射壓強產生的機械效應、空化效應和熱效應來加速物質的擴散溶解，有效地提高化合物提取的得率和含量，具有成本低、提取效率高、提取量大、時間短等優(yōu)點。響應面分析法（response surface methodology，RSM），是一種優(yōu)化工藝參數(shù)的有效方法，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量及因素交互影響的問題。因此，本試驗采用超聲輔助提取技術對貴州野生插田泡果實花色苷進行提取，并在單因素試驗的基礎上，利用響應曲面法優(yōu)化超聲提取工藝，以期為插田泡果實花色苷資源的全面高效利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生插田泡果實2018 年6 月采自貴州省安順市西秀區(qū)，挑選完全成熟的紫黑色果實去離子水洗凈后置于-40 ℃冰箱內冷凍儲存，試驗前室溫、避光條件下解凍。無水乙醇、醋酸鈉、氫氧化鈉、氯化鉀（均為分析純）：重慶川東化工集團有限公司。

1.2 儀器與設備

FA1104 電子天平：上海舜禹恒平科學儀器有限公司；PHS-3C 精密酸度計：上海雷磁·創(chuàng)益儀器儀表有限公司；KQ-300DE 數(shù)顯溫超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BluStar-A 掃描型紫外可見分光光度計：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水多用真空泵：北京市泰和格潤儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最大吸收波長的測定

準確稱取1.0 g 插田泡成熟果實于研缽中研磨5 min，多次少量加入體積分數(shù)75%乙醇溶液（pH3）（共用30 mL）洗滌研缽，溶液及果實均轉移至具塞錐形瓶中，超聲振蕩提取20 min，抽濾，濾液于200 nm～600 nm 范圍內掃描，以確定插田泡果實花色苷的最大吸收波長。

1.3.2 花色苷含量的檢測

1.3.2.1 超聲輔助提取流程

稱取室溫解凍果實1 g→研磨5 min→加入75%乙醇溶液→超聲輔助提取→抽濾→收集濾液→定容至100 mL→花色苷粗提液

1.3.2.2 花色苷含量的測定及計算

準確移取氯化鉀緩沖液（pH1.0）3 mL 與1 mL 插田泡果實花色苷粗提液混合，搖勻；另準確移取醋酸鈉緩沖溶液（pH4.5）3 mL 與1 mL 插田泡果實花色苷粗提液與混合，搖勻?？瞻讓φ諡楦鲗木彌_溶液，于插田泡果實花色苷最大吸收波長538 nm 處測吸光度，按照以下公式（1）計算花色苷含量[1]：

式中：X為插田泡果實花色苷得率，mg/100 g；ΔT為ApH1和ApH4.5的吸光度差值；V為插田泡果實花色苷提取液的總體積，mL；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，449 g/mol；ε 為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，29 600 L/（mol·cm）；m為樣品質量，g；b為比色皿厚度，1 cm。

1.3.3 單因素試驗

按1.3.2節(jié)方法，提取插田泡果實花色苷，提取條件為：固定反應條件為溶劑75 %乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃、提取時間30 min，考察不同超聲功率（120、150、180、210、240 W）對花色苷得率的影響；固定反應條件為超聲功率150 W、溶劑75%乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃，考察不同超聲提取時間（20、30、40、50、60 min）對花色苷得率的影響；固定反應條件為超聲功率150 W、溶劑75 %乙醇（pH3）、料液比1 ∶20（g/mL）、提取時間30 min，考察不同提取溫度（水溫16、20、30、40、50 ℃）對花色苷得率的影響；固定反應條件為超聲功率150 W、料液比1 ∶20（g/mL）、溫度50 ℃、提取時間30 min，考察不同乙醇體積分數(shù)（55%、65%、75%、85%、95%）（pH3）對花色苷得率的影響；固定反應條件為溶劑75%乙醇（pH3）、超聲功率150 W、溫度50 ℃、提取時間30 min，考察不同料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL）]對花色苷得率的影響；固定反應條件為溶劑75%乙醇、超聲功率150 W、溫度50 ℃、料液比1 ∶20（g/mL），考察不同乙醇pH 值（1、2、3、4、5）對花色苷得率的影響。進行單因素試驗，考察各因素變量對插田泡果實花色苷得率的影響。

1.3.4 響應面試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選擇超聲功率（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、料液比（D）4 個因素，利用Design-Expert 8.6 軟件，根據(jù)Box-Behnken 試驗設計原理，響應值為插田泡果實花色苷得率（Y），進行四因素三水平響應面優(yōu)化試驗設計，以確定插田泡果實花色苷的最佳超聲提取條件，因素水平編碼見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的測定

插田泡花色苷紫外-可見光譜圖見圖1。

圖1 插田泡花色苷紫外-可見光譜圖Fig.1 UV-visible spectrum of Rubus coreanus Maq.anthocyanin

文獻報道，花色苷類物質的紫外及可見分光光譜圖中有兩個特征吸收峰：一個在270 nm～290 nm 附近，與苯甲?；嘘P；另一個在500 nm～540 nm，與肉桂?；嘘P[4，22]。如圖1所示，插田泡果實花色苷在292 nm和538 nm 波長處有兩個特征吸收峰。因此，插田泡果實花色苷乙醇溶液中的最大吸收波長為538 nm，作為本試驗的測定波長。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 超聲功率對花色苷得率的影響

超聲功率對花色苷得率的影響見圖2。

如圖2所示，插田泡果實花色苷的得率隨著超聲功率的升高先呈上升趨勢。超聲功率的升高使花色苷更易溶出，花色苷得率升高。功率為150 W 時，花色苷得率最大，隨后得率呈下降趨勢。原因是超聲功率的增大加快了插田泡果實外皮細胞壁破裂速度[11]，花色苷加速溶出，但功率過高，造成溶液體系溫度太高，插田泡花色苷的糖苷分離[23]，從而導致花色苷分解，得率下降。所以，選擇超聲功率120、150、180 W 3 個水平條件設計響應面試驗。

2.2.2 超聲提取時間對花色苷得率的影響

超聲提取時間對花色苷得率的影響見圖3。

圖2 超聲功率對花色苷得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on anthocyanins yield

圖3 超聲提取時間對花色苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on anthocyanins yield

如圖3所示，插田泡果實花色苷得率隨超聲提取時間先快速增大，隨后緩慢下降。說明超聲提取30 min時，插田泡樣品與乙醇溶劑充分接觸，達到傳質飽和，此時插田泡果實花色苷已經充分溶出，得率最高；繼續(xù)增加超聲提取時間，會破壞花色苷分子結構，導致部分花色苷分解[11，24]，降低得率。所以，選擇超聲提取時間20、30、40 min 3 個水平條件設計響應面試驗。

2.2.3 超聲提取溫度對花色苷得率的影響

提取溫度對花色苷得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對花色苷得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on anthocyanins yield

如圖4所示，在不加熱的情況下，溶液室溫16 ℃超聲提取時，插田泡花色苷的得率最高。其后隨著超聲提取溫度的升高，會導致插田泡果實花色苷得率下降。40 ℃前花色苷得率下降較緩慢，40 ℃后花色苷得率下降較為顯著。這是由于插田泡花色苷對熱十分敏感，超聲提取溶液溫度高于16 ℃即會破壞插田泡花色苷結構的穩(wěn)定性[11]，造成花色苷的降解。因此，本試驗超聲提取時不加熱，溶液室溫即為最佳提取條件。

2.2.4 乙醇體積分數(shù)（pH3）對花色苷得率的影響

乙醇體積分數(shù)對花色苷得率的影響見圖5。

圖5 乙醇體積分數(shù)對花色苷得率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on anthocyanins yield

如圖5所示，插田泡果實花色苷的得率先隨著乙醇體積分數(shù)的增加逐漸增大，當乙醇體積分數(shù)超過75%時，花色苷得率減少。這是由于溶液中適當增加乙醇等有機溶劑能促使植物花色苷中氫鍵斷裂，小分子的花青素溶出，使溶液中的色素含量提高；但隨著乙醇體積分數(shù)超過75%，溶液的極性降低，偏離了插田泡花色苷的極性，親水性花色苷的析出減少，導致總花色苷得率降低[25-27]。所以，選擇乙醇體積分數(shù)65%、75%、85%3 個水平條件設計響應面試驗。

2.2.5 料液比對花色苷得率的影響

料液比對花色苷得率的影響見圖6。

圖6 料液比對花色苷得率的影響Fig.6 Effect of solid-to-liquid ratio on anthocyanins yield

如圖6所示，隨著料液比液體量增大，插田泡果實花色苷得率先逐漸增大后減小?？赡茉蚴橇弦罕容^小，插田泡果實浸泡不完全，造成花色苷浸提不完全。當料液比達到1∶30（g/mL）時，樣品花色苷提取完全。料液比繼續(xù)增大，此時乙醇體積增加，花色苷結構遭到有機溶劑的破壞，導致其提取量下降，得率降低[25]。所以，選擇料液比1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）3 個水平條件設計響應面試驗。

2.2.6 乙醇pH 值對花色苷得率的影響

乙醇pH 值對花色苷得率的影響見圖7。

圖7 乙醇pH值對花色苷得率的影響Fig.7 Effect of different acidity ethanol on anthocyanins yield

如圖7所示，插田泡果實花色苷得率隨酸化乙醇pH 值的增加先增大后減少。溶液酸度較高時，花色苷分子大多以非離子化形式存在，造成樣品花色苷得率較低；當pH 值為2 時，樣品花色苷結構穩(wěn)定，以紅色黃烊鹽陽離子形式存在，得率最大；當pH 值逐漸增大，溶液酸度逐漸降低，花色苷分子結構逐漸由紅色黃烊鹽陽離子形式向無色查爾酮轉變，溶液顏色變淺[25]，花色苷得率逐漸減少。說明花色苷類物質的提取應在適宜酸度范圍內進行，否則酸度過高（如pH1）或過低將導致花色苷的水解及降解，穩(wěn)定性降低。因此，本試驗酸化乙醇的pH 值為2 較為合適。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果分析

基于單因素試驗結果，選擇對插田泡果實花色苷含量影響較顯著的4 個因素超聲功率（A）、超聲提取時間（B）、乙醇體積分數(shù)（C）、料液比（D），以花色苷得率（Y）為響應值，進行響應面優(yōu)化試驗。設計了四因素三水平響應面試驗，共有29 個試驗，以確定插田泡果實花色苷最佳超聲提取工藝參數(shù)，方案設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Expertmental design and results for response surface analysts

續(xù)表2 響應面試驗設計與結果Continue table 2 Expertmental design and results for response surface analysts

用Design-Expert 8.0.6 軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，得到插田泡果實花色苷得率（Y）的二次多項回歸方程預測模型為Y= 248.578 00-7.175 00A-5.160 00B-2.738 33C+5.853 33D+5.370 00AB+21.447 50-15.237 50AD+0.042 500BC-24.427 50BD+6.120 00CD-47.256 50A2-20.931 50B2-27.599 00C2-7.734 00D2。

2.3.2 響應面試驗方差分析結果

采用Design Expert 8.0.6 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得到回歸方程方差分析表3。

由表3可知，回歸模型F 值較高為25.72，P＜0.000 1，說明此回歸模型極顯著，具有統(tǒng)計學意義；方程的失擬項P值為0.985 3 ＞0.05，不顯著，表明該回歸模型擬合程度較好，無失擬因素存在，誤差小，該方法的擬合效果較好。由校正絕對系數(shù)R2（0.962 6 ＞0.80）和變異系數(shù)CV 為4.01%，說明該模型只有3.74%的變異，進一步說明模型擬合程度較好，回歸模型方程代表性較好，響應值的變化有96.26%來自于所選的變量；模型調整系數(shù)R2Adj為0.925 1 說明模型的預測性較好，實際值與預測值是較接近；模型精密度為18.139，大于4，說明此模型是可行的[26]。因此，可用該回歸模型方程代替試驗真實點對試驗結果進行預測分析，該模型可用來對超聲提取插田泡果實花色苷的工藝條件優(yōu)化。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

回歸模型方程中的一次項超聲功率（A）、超聲提取時間（B）、料液比（D）影響顯著（P＜0.05）；二次項超聲功率與乙醇體積分數(shù)交互項（AC）、超聲功率與料液比交互項（AD）、料液比二次項（D2）影響顯著（P＜0.05）；二次項超聲提取時間與料液比交互項（BD）、超聲功率二次項（A2）、超聲提取時間二次項（B2）、乙醇體積分數(shù)二次項（C2）對花色苷得率的影響極顯著（P＜0.000 1）。由各因素F 值的大小可知，4 個因素對花色苷得率的影響程度次序為超聲功率（FA=9.09）＞料液比（FD=6.05）＞超聲提取時間（FB=4.70）＞乙醇體積分數(shù)（FC=1.32）。

2.3.3 交互作用對花色苷得率的影響

根據(jù)回歸方程繪出響應面圖及等高線圖，分析超聲功率、超聲提取時間、乙醇體積分數(shù)、料液比4 個因素對插田泡果實花色苷得率的交互影響。

各因素交互作用對插田泡果實花色苷得率的影響，可根據(jù)圖8響應曲面圖及等高線圖直觀地進行判斷。圖中曲面越陡峭，說明兩因素的交互作用越顯著，對花色苷得率的影響越大；等高線圖中形狀為圓形說明兩因素交互作用不顯著，為橢圓形說明兩因素交互作用顯著[28]。從圖8中可以看出，超聲功率和超聲提取時間之間交互作用較弱，超聲功率對插田泡花色苷得率的影響大于超聲提取時間；超聲功率和乙醇體積分數(shù)之間具有顯著的交互作用，超聲功率對花色苷得率的影響大于乙醇體積分數(shù)；超聲功率和料液比的交互作用也較顯著，超聲功率對花色苷得率的影響略大于料液比；超聲提取時間和乙醇體積分數(shù)交互作用不顯著，超聲提取時間對花色苷得率的影響略大于乙醇體積分數(shù)；超聲提取時間和料液比之間具有極為顯著的交互作用，響應曲面中曲線較陡和等高線中形狀為明顯的橢圓形，其中料液比對花色苷得率的影響略大于超聲提取時間；乙醇體積分數(shù)和料液比之間交互作用不顯著，但料液比的曲面較陡，其對花色苷得率的影響大于乙醇體積分數(shù)。以上分析結果與表3方差分析結果相吻合。

圖8 兩因素交互作用對花色苷得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactions of two factors on anthocyanin yield

2.3.4 最優(yōu)工藝條件的確定及驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6 軟件分析得到插田泡果實花色苷的最佳超聲提取條件為超聲功率141.30 W、超聲提取時間22.60 min、乙醇體積分數(shù)74.52%（pH2）、料液比1∶40（g/mL），此條件下插田泡果實花色苷的得率為260.883 mg/100 g?？紤]實際操作，將以上條件調整為超聲功率141 W、超聲提取時間22.60 min、乙醇體積分數(shù)74.50%（pH2）、料液比1∶40（g/mL）進行3 次平行試驗，測得插田泡果實花色苷得率為263.15 mg/100 g，與模擬計算機值基本接近，表明預測值與真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

3 結論

根據(jù)單因素試驗結果，采用響應曲面法優(yōu)化超聲提取插田泡果實花色苷的工藝參數(shù)，建立了回歸模型方程，根據(jù)模型確定了插田泡花色苷的最佳提取工藝參數(shù)為超聲功率141 W、超聲提取時間22.60 min、乙醇體積分數(shù)74.50%（pH2）、料液比1∶40（g/mL），該條件下插田泡花色苷的實際得率可達263.15 mg/100 g，與預測值接近，高于采用振蕩提取的花色苷得率211.05 mg/100 g[1]。說明超聲輔助萃取技術比溶劑振蕩提取方法更有利于花色苷組分的浸出，耗時短，萃取效率更高，可為插田泡果實花色苷提取新工藝提供依據(jù)。