元寶楓葉中單寧的含量測(cè)定

李知陸，康欣，李哲，賈有青，陳文慶，單秀峰，肖志剛

（沈陽(yáng)師范大學(xué)，遼寧沈陽(yáng)110034）

元寶楓[1]在生長(zhǎng)期的葉和種子富集了較多脂肪酸、蛋白質(zhì)和單寧[2]。單寧是一種水溶性的酚類化合物，是食品中常見(jiàn)的化學(xué)物質(zhì)，具有一定的抗氧化性和抑制蛋白酶活力及清除自由基的作用[3-6]。遼寧是元寶楓的主要產(chǎn)區(qū)，因其種子的形狀類似“金元寶”而得名，元寶楓有著悠久的種植記錄，本次試驗(yàn)樣品采集于遼寧鐵嶺縣營(yíng)盤(pán)村種植基地。試驗(yàn)測(cè)試采用的國(guó)標(biāo)參照：GB/T 27985-2011《飼料中單寧的測(cè)定分光光度法》。本試驗(yàn)通過(guò)鎢酸鈉-磷鉬酸比色法[7]對(duì)加熱時(shí)間、溫度和料液比的不同水平的預(yù)處理方法進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)；進(jìn)而找到優(yōu)化的檢測(cè)條件[8]，提取出更多的單寧，為元寶楓副產(chǎn)品的研發(fā)提供依據(jù)[9-12]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

752N 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SB25-12DTDN 超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ESJ120-48 型電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；GFL-125 電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 試劑

元寶楓葉：遼寧鐵嶺營(yíng)盤(pán)子村元寶楓基地；鎢酸鈉（分析純）、鉬酸鈉（分析純）、磷酸（分析純）、鹽酸（分析純）、硫酸鋰（分析純）、無(wú)水碳酸鈉（分析純）、沒(méi)食子酸（基準(zhǔn)試劑）：上海同田生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將500 g 元寶楓葉放置于60 ℃烘箱中烘至恒重。干燥避光密封保存，備用。

1.2.2 試劑配制

鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液：稱取50.0 g 鎢酸鈉，12.5 g 鉬酸鈉，用350 mL 水溶解到1 000 mL 回流瓶中，加入25 mL 磷酸及50 mL 鹽酸，充分混勻，小火加熱回流1.5 h，再加入75 g 硫酸鋰，25 mL 蒸餾水，冷卻，轉(zhuǎn)入500 mL 容量瓶定容，過(guò)濾，置棕色瓶中保存，使用時(shí)稀釋1 倍。原液在室溫下可保存半年。

75 g/L 碳酸鈉溶液：稱取37.5 g 無(wú)水碳酸鈉溶于250 mL 溫水中，混勻，冷卻，稀釋至500 mL，過(guò)濾到儲(chǔ)備瓶中備用。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.110 0 g 沒(méi)食子酸溶解并定容至100 mL，此溶液的質(zhì)量濃度為1 000 mg/L。在冰箱2 ℃～3 ℃下可保存5 d。

沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：分別吸取1 000 mg/L 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL容量瓶中，定容，溶液質(zhì)量濃度分別為0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

1.2.3 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)使用液各1.0 mL，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，混勻，沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度[13-16]。

1.2.4 單寧測(cè)定的工作流程

元寶楓楓葉選樣→烘干→稱重→水提→超聲→取液→測(cè)量

1.2.5 單寧含量測(cè)定的單因素試驗(yàn)

通過(guò)控制試驗(yàn)的水浴溫度、加熱時(shí)間、樣品稀釋倍數(shù)3 個(gè)因素來(lái)測(cè)定元寶楓葉中單寧的含量。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水[17]，在超聲裝置中加熱40 min，水浴溫度分別為50、60、70 ℃，上述操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度[18]，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱時(shí)間分別為20、40、60 min，水溫為60 ℃，上述操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），在超聲裝置中加熱時(shí)間為40 min，水溫為60 ℃，分別將樣品與水按1∶90、1∶120、1∶150（g/mL），上述操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓楓葉中單寧含量作圖。

1.2.6 元寶楓楓葉中單寧含量測(cè)定的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用三因素三水平的正交試驗(yàn)，即L9（33），確定最佳因素水平，得出單寧最低含量[19]，因素水平表如表1。

表1 元寶楓葉中單寧的因素水平表Table 1 The factors of tannin in Acer truncatum Bunge leaves

1.2.7 樣品中單寧含量的計(jì)算方法

式中：ω 為試樣中單寧含量，mg/L；ρ 為試樣測(cè)定液中沒(méi)食子酸的濃度，mg/L；10 為試樣測(cè)定液定容體積，L；A 為樣品稀釋倍數(shù)；m 為試樣體積，L。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

首先測(cè)出沒(méi)食子酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.990 3，關(guān)系式為y=0.034x+0.028 8。

沒(méi)食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 沒(méi)食子酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid solution

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 水浴溫度對(duì)單寧含量測(cè)定的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱40 min，水浴溫度分別為50、60、70 ℃，上述操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖[20]。經(jīng)過(guò)平行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)水浴溫度對(duì)單寧含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 水浴溫度對(duì)單寧含量的影響Fig.2 Effect of water bath temperature on tannin content

從圖2可以看出，水浴溫度為50 ℃～60 ℃時(shí)，隨著水浴溫度的增加，元寶楓葉中單寧含量呈上升趨勢(shì)，60 ℃以后，再隨著水浴溫度的增加，元寶楓楓葉中單寧含量不再改變，所以水浴溫度為60 ℃時(shí)提取元寶楓楓葉中單寧含量最多。

2.2.2 加熱時(shí)間對(duì)單寧含量測(cè)定的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），加入350 mL 水，在超聲裝置中加熱時(shí)間分別為20、40、60 min，水溫為60 ℃，操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL 鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖。經(jīng)過(guò)平行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)加熱時(shí)間對(duì)單寧含量的影響見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，加熱時(shí)間為20 min～40 min 時(shí)，隨著加熱時(shí)間的長(zhǎng)，提取元寶楓楓葉中單寧含量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，40 min 以后，隨著加熱時(shí)間的繼續(xù)增長(zhǎng)，單寧含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，所以加熱時(shí)間為40 min時(shí)提取元寶楓葉中單寧含量最多。

圖3 加熱時(shí)間對(duì)單寧含量的影響Fig.3 Effect of heating time on tannin content

2.2.3 樣品稀釋倍數(shù)對(duì)單寧含量的影響

稱取3.06 g 元寶楓干樣楓葉（相當(dāng)于10 g 元寶楓濕樣楓葉），在超聲裝置中加熱時(shí)間為40 min，水溫為60 ℃，分別加入260、350、435 mL 水，上述操作結(jié)束后，分別吸取1 mL 提取液，分別加5.0 mL 水，1.0 mL鎢酸鈉-鉬酸鈉混合溶液和3.0 mL 碳酸鈉溶液，顯色，放置2 h，在波長(zhǎng)為765 nm 處測(cè)定溶液的吸光度，以吸光度代表元寶楓葉中單寧含量作圖。經(jīng)過(guò)平行試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)樣品稀釋比例對(duì)單寧含量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 樣品稀釋比例對(duì)單寧含量的影響Fig.4 Effect of dilution ratio of sample on tannin content

從圖4可以看出，樣品稀釋比例即楓葉與水配比從1∶90（g/mL）到1∶120（g/mL）時(shí)，提取元寶楓楓葉中單寧含量升高，楓葉與水配比在1∶120（g/mL）以后，單寧含量就逐漸降低，所以單寧在楓葉與水配比1∶120（g/mL）時(shí)，提取元寶楓楓葉中單寧含量是最多的。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，最終得出單寧檢測(cè)的較佳條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

通過(guò)極差分析可看出，R（C）＞R（B）＞R（A），所以影響元寶楓葉單寧含量的因素主要大小為：樣品料液比（C）＞加熱時(shí)間（B）＞水浴溫度（A），即料液比影響最大，水浴溫度影響最小，從正交試驗(yàn)中可以得到提取元寶楓葉單寧含量的最佳條件為A3B2C1，即水浴溫度為70 ℃，加熱時(shí)間為40 min，元寶楓葉與水的比例為1∶90（g/mL）。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)測(cè)試和計(jì)算得到提取元寶楓葉中單寧的含量為338.9 g/kg

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 Table of orthogonal experimental results

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)通過(guò)控制水浴溫度、加熱時(shí)間、樣品稀釋比例測(cè)定元寶楓楓葉中單寧的含量的基礎(chǔ)上；又通過(guò)正交試驗(yàn)，控制不同因素水平，得到了提取單寧的較佳條件，即水浴溫度為70 ℃，加熱時(shí)間為40 min，楓葉與水的比例為1∶90（g/mL）時(shí)，提取元寶楓楓葉中單寧的含量為338.9 g/kg